Inledning
Kolonnkromatografi är en vidareutveckling av tunnskiktskromatografi (TLC). Vi förutsätter att läsaren har viss erfarenhet av laboratoriearbete och har arbetat med tunnskiktskromatografi. Istället för att applicera ett prov på ett tunt lager av kiseldioxid eller aluminiumoxid, deponeras ett prov på en cylinder av adsorbent och lösningsmedel appliceras kontinuerligt med tryck tills komponenterna helt dräneras från cylindern. Med denna modifiering kan komponenterna inte bara separeras utan även samlas upp i olika behållare, vilket möjliggör rening av blandningar och separering av läkemedel med föroreningar. Kolonnkromatografi (även känd som "flashkromatografi") används ofta i forskningssammanhang, vilket framgår av att den ofta förekommer i proceduravsnitten i tidskriftsartiklar.
Diskussion om procedur
Samma underliggande principer som gäller för tunnskiktskromatografi (TLC) gäller för kolonnkromatografi. Faktum är att en TLC alltid körs innan en kolonn utförs för att bedöma situationen och bestämma rätt lösningsmedelsförhållande. För att få bra separation är det idealiskt om den önskade komponenten har en Rf runt 0,35 (läs om Rf i TLC-ämnet) och är separerad från andra komponenter med minst 0,2 Rf-enheter. Om de fläckar som ska separeras ligger mycket nära varandra (om skillnaden i Rf är < 0,2) är det bäst om mitten av fläckarna har ett Rf på 0,35. En Rf nära 0,35 är idealisk eftersom den är tillräckligt långsam för att stationär-mobil fasjämvikt ska kunna uppstå, men tillräckligt snabb för att minimera bandbreddning från diffusion.
Det finns några variabler som inte är tillämpliga på TLC, men som påverkar separationen av komponenter i kolonnkromatografi. Dessa inkluderar kolonndiametern, mängden adsorbent som används och lösningsmedlets flödeshastighet. Bild. 1 visar variabla rekommendationer baserade på provstorlek och separationsgrad mellan komponenterna. I alla scenarier ska kolonnerna förberedas mellan 12,5-15 cm höga.
Det finns några variabler som inte är tillämpliga på TLC, men som påverkar separationen av komponenter i kolonnkromatografi. Dessa inkluderar kolonndiametern, mängden adsorbent som används och lösningsmedlets flödeshastighet. Bild. 1 visar variabla rekommendationer baserade på provstorlek och separationsgrad mellan komponenterna. I alla scenarier ska kolonnerna förberedas mellan 12,5-15 cm höga.
En kolonn på 2,5 cm bör t.ex. kunna rena ca 400 mg material om separationen är god (ΔRf > 0,2, tredje kolumnen i bild 1), eller ca 160 mg om separationen är svår (ΔRf > 0,1). Kolonnen bör kunna prepareras och elueras med ca 200 ml lösningsmedel och fraktionerna kan samlas upp med ca 10 ml lösning vardera.
Det finns många olika varianter på hur man fysiskt kör en kolonn. En stor skillnad i metoderna är hur kolonnen förbereds. Vid "dry packing"-metoden tillsätts torr kiseldioxid eller aluminiumoxid direkt till en kolonn och lösningsmedlet får sippra igenom i portioner och sedan med tryck. I "wet packing"-metoden fylls kolonnen först med lösningsmedel, sedan skakas torr kiseldioxid eller aluminiumoxid lätt i och packas sedan med tryck. I "slurry"-metoden tillsätts lösningsmedel till kiseldioxid eller aluminiumoxid i en Erlenmeyerkolv, hälls på kolonnen som ett slammigt material och packas sedan med tryck (trycket kan produceras med hjälp av en spruta).
Det är viktigt att känna till att värme frigörs när lösningsmedel tillsätts till kiseldioxid eller aluminiumoxid (de har en exoterm solvationsvärme). Slurrymetoden presenteras i detta avsnitt, och huvudskälet är att den gör att detta exoterma steg kan ske i en Erlenmeyerkolv i stället för i kolonnen. Om värme frigörs under packningen av kolonnen kan det generera bubblor från kokningen av lösningsmedlet. Dessa bubblor kan störa separationen av kolonnen om de inte avlägsnas på lämpligt sätt, och de kan spräcka det adsorberande materialet i kolonnen.
Det finns många olika varianter på hur man fysiskt kör en kolonn. En stor skillnad i metoderna är hur kolonnen förbereds. Vid "dry packing"-metoden tillsätts torr kiseldioxid eller aluminiumoxid direkt till en kolonn och lösningsmedlet får sippra igenom i portioner och sedan med tryck. I "wet packing"-metoden fylls kolonnen först med lösningsmedel, sedan skakas torr kiseldioxid eller aluminiumoxid lätt i och packas sedan med tryck. I "slurry"-metoden tillsätts lösningsmedel till kiseldioxid eller aluminiumoxid i en Erlenmeyerkolv, hälls på kolonnen som ett slammigt material och packas sedan med tryck (trycket kan produceras med hjälp av en spruta).
Det är viktigt att känna till att värme frigörs när lösningsmedel tillsätts till kiseldioxid eller aluminiumoxid (de har en exoterm solvationsvärme). Slurrymetoden presenteras i detta avsnitt, och huvudskälet är att den gör att detta exoterma steg kan ske i en Erlenmeyerkolv i stället för i kolonnen. Om värme frigörs under packningen av kolonnen kan det generera bubblor från kokningen av lösningsmedlet. Dessa bubblor kan störa separationen av kolonnen om de inte avlägsnas på lämpligt sätt, och de kan spräcka det adsorberande materialet i kolonnen.
Steg-för-steg-förfaranden
a) TLC av ferrocen/acetylferrocen-blandningen, b) kolonnkromatografi
Kolonnen som visas i detta avsnitt visar rening av ett 0,20 g prov som innehåller en blandning av ferrocen och acetylferrocen (TLC för råvara finns i Fig. 2 a). Ungefär 8 ml fraktioner samlades upp i små provrör och ungefär 400 ml eluent användes.
a) TLC-platta med rå ferrocen/acetylferrocen-blandning före eluering, b) Efter eluering, c) Kolonn med frit, d) Kolonn med bomull kilad i botten, e) Kolonn utan bomullskil (måste sättas in före användning)
Kör enTLC
1 ) Gör en TLC på det prov som ska renas (fig. 3 a och b) för att bestämma lämpligt lösningsmedel för kromatografin. Den önskade komponenten bör ha en Rf runt 0,35 och bör helst vara separerad från alla andra fläckar med minst 0,2 Rf-enheter.
2) Bered en sats eluent som ger rätt Rf-värde. Hur mycket som ska beredas beror på mängden prov, kolonnens storlek och om lösningsmedlets sammansättning planeras att ändras halvvägs. (Se fig. 1 för riktlinjer och den eluotropiska serien för trender i "lösningsmedelseffekt").
2) Bered en sats eluent som ger rätt Rf-värde. Hur mycket som ska beredas beror på mängden prov, kolonnens storlek och om lösningsmedlets sammansättning planeras att ändras halvvägs. (Se fig. 1 för riktlinjer och den eluotropiska serien för trender i "lösningsmedelseffekt").
Förbereda den packade kolonnen
3 ) Skaffa en lämplig kolonn (se fig. 1) och se till att det finns något nära stoppkranen som gör att vätska kan passera, men inte fast material. Kolonnerna kan ha en sintrad skiva (även kallad "frit"), Fig.3 c), eller en plugg av bomull eller glasull som är kvar från den tidigare användaren (Fig.3 d). Om det inte finns någon disk eller plugg (fig. 3 e), kila in en liten bomullstuss eller glasull i kolonnens botten med hjälp av en lång stav.
Fig.
a) Häll i kiseldioxid till en höjd av 12,5-15 cm i dragskåpet, b) Häll kiseldioxiden i en Erlenmeyerkolv, c och d) Gör en slurry
a) Häll i kiseldioxid till en höjd av 12,5-15 cm i dragskåpet, b) Häll kiseldioxiden i en Erlenmeyerkolv, c och d) Gör en slurry
Säkerhetsanmärkning: Kiseldioxid och aluminiumoxid i pulverform är irriterande för lungorna och ska alltid hanteras försiktigt i ett dragskåp. Spillt damm ska tas om hand genom att torka upp det med en våt pappershandduk (om den är våt är de fina partiklarna mindre spridda).
5) Häll det adsorbent som uppmätts i kolonnen i en Erlenmeyerkolv (fig.4 b) i dragskåpet och tillsätt sedan lite elueringsmedel (fig.4 c). Gör en lös uppslamning genom att virvla och röra om med en glasomrörarstav (fig. 4 d) tills allt adsorbent är helt vått, gasbubblor släpps ut och konsistensen är något tjock, men hällbar.
a) Häller uppslamningen i kolonnen, b) Sköljer kolven, c) Adsorbent som fastnat på kolonnens sidor, d) Sköljer bort det fastklämda adsorbenten
6 ) Placera en bägare eller Erlenmeyerkolv under den fastspända kolonnen och öppna stoppkranen. I en snabb rörelse, virvla och häll kiseldioxid- eller aluminiumoxiduppslamningen i kolonnen med hjälp av en tratt med stor mun (fig. 5 a). Använd omedelbart mer elueringsmedel för att skölja ut resterande slurry ur Erlenmeyerkolven (fig. 5 b) och på kolonnen.
7 ) Skölj omedelbart bort eventuell kiseldioxid eller aluminiumoxid från kolonnbehållarens sidor med hjälp av elueringsmedel och en virvlande rörelse från en pasteurpipett (fig. 5 c och d). Om adsorbenten får torka kommer den att fastna på glaset och blir inte lätt att skölja bort.
7 ) Skölj omedelbart bort eventuell kiseldioxid eller aluminiumoxid från kolonnbehållarens sidor med hjälp av elueringsmedel och en virvlande rörelse från en pasteurpipett (fig. 5 c och d). Om adsorbenten får torka kommer den att fastna på glaset och blir inte lätt att skölja bort.
a) Skaka kolonnen för att avlägsna luftbubblor, b) Applicera lufttryck, c) Tillsätta sand, d) Skölja bort sand från sidorna
8 ) Skaka kolonnen ordentligt med hjälp av en korkring eller dina knogar (fig. 6 a) för att få bort eventuella luftbubblor i kolonnen (som kan orsaka dålig separation eller sprickbildning av adsorbenten i kolonnen) och för att främja en jämn deponering av adsorbenten.
9) Applicera ett lätt lufttryck på kolonnens topp (fig. 6 b) för att komprimera den, och sluta när eluentnivån är 1 cm från kolonnens topp. Om en T-adapter används med luftledningen som i fig. 6 b, kan luftflödet finjusteras genom att justera klämklämman på gummislangen. Under hela elueringsprocessen ska den vita kolonnen med adsorbent hållas våt, med elueringsnivån ovanför toppen av kiseldioxiden eller aluminiumoxiden. Bryt försiktigt tätningen för att upphöra med trycket och stäng stoppkranen för att förhindra att vätska droppar ut ytterligare.
10) Lägg på ett tunt sandlager (fig. 6 c), ca 0,5 cm högt. Skölj kolonnens sidor med elueringsvätska med en virvlande rörelse för att lossa sanden från glasets sidor (fig. 6 d). Öppna stoppkranen och låt vätskan droppa ut tills vätskan befinner sig strax ovanför sandlagret. Applicera lufttryck om droppningen är för långsam.
9) Applicera ett lätt lufttryck på kolonnens topp (fig. 6 b) för att komprimera den, och sluta när eluentnivån är 1 cm från kolonnens topp. Om en T-adapter används med luftledningen som i fig. 6 b, kan luftflödet finjusteras genom att justera klämklämman på gummislangen. Under hela elueringsprocessen ska den vita kolonnen med adsorbent hållas våt, med elueringsnivån ovanför toppen av kiseldioxiden eller aluminiumoxiden. Bryt försiktigt tätningen för att upphöra med trycket och stäng stoppkranen för att förhindra att vätska droppar ut ytterligare.
10) Lägg på ett tunt sandlager (fig. 6 c), ca 0,5 cm högt. Skölj kolonnens sidor med elueringsvätska med en virvlande rörelse för att lossa sanden från glasets sidor (fig. 6 d). Öppna stoppkranen och låt vätskan droppa ut tills vätskan befinner sig strax ovanför sandlagret. Applicera lufttryck om droppningen är för långsam.
Tillsättprovet
När provet har applicerats på kolonnen är det en kamp mot klockan, eftersom diffusionen kommer att börja bredda materialet. Ett prov bör inte appliceras förrän du är redo att slutföra kolonnen omedelbart och i sin helhet. Denna process kan ta mellan 15 och 90 minuter! Om du använder provrör för att samla in fraktioner ska provrören placeras i ett ställ innan du tillsätter provet, och kolonnens höjd ska justeras så att provrörsstället kan glida under.
a) Upplösning av ett fast ämne med en liten mängd diklormetan, b) Applicering av provet, c) Sköljning av provet i kolven, d) Tryck för att trycka upp provet på kolonnen strax efter sandlagret
11) Om råprovet är en vätska, använd den direkt (gå vidare till steg 13).
12) Om råprovet är ett fast ämne ska du göra något av följande.
12) Om råprovet är ett fast ämne ska du göra något av följande.
a) Idealsituation: lös upp det fasta ämnet i minsta möjliga mängd av elueringsmedlet (högst några ml).
b) Om det fasta ämnet inte är särskilt lösligt eller inte löses upp i några ml av eluenten, lös det i minsta möjliga mängd diklormetan (högst några ml, fig. 7 a).
c) Om det fasta ämnet är olösligt i eluenten kan man också använda ett alternativt förfarande. Lös upp det fasta ämnet i en rundbottnad kolv med några ml av ett lågkokande lösningsmedel (t.ex. diklormetan eller aceton). Tillsätt ca 1 g kiseldioxid eller aluminiumoxid i kolven och avlägsna sedan lösningsmedlet på en roterande indunstare så att ett fast ämne återstår som innehåller det prov som deponerats på adsorbenten. Häll det kiseldioxidadsorberade provet på kolonnen med hjälp av en tratt med vid mynning, medan en tum elueringsvätska vilar ovanpå den packade kolonnen (hoppa över sandlagret om denna metod används). Om det fastnar damm på glaset, skölj det med mer elueringsmedel (gå vidare till steg 15).
13) Tillsätt försiktigt provet till kolonnen med pipett genom att droppa vätskan eller lösningen direkt på sanden med pipettspetsen så nära som möjligt, inte längs sidorna (fig. 7 b). Var försiktig så att du inte sprutar in vätska med våld så att det uppstår intryckningar i sanden eller kiseldioxid-/aluminiumoxidkolonnen.
14) Skölj provbehållaren med lite lösningsmedel (eller diklormetan om sådan används, fig. 7 c) och tillsätt sköljningen till kolonnen med samma pipett (för att även skölja pipetten).
15) Öppna stoppkranen och låt vätskan droppa ut tills provet har passerat sandlagret (fig. 7 d) och hamnat i det vita området på kolonnen (använd lufttryck om detta tar mer än 20 sekunder).
16) Skölj försiktigt kolonnens sidor med en virvlande rörelse och använd 1-2 pipetter fulla med elueringsvätska för att skölja bort eventuellt stänkt prov. Låt vätskan droppa ut igen (eller använd lufttryck) tills provet trycks in i den vita adsorbenten.
Upprepa sköljningssteget tills du känner dig säker på att hela provet har placerats på adsorbenten. Om en del av provet fortfarande finns kvar i sandlagret kan det lösas upp i eluenten när mer lösningsmedel tillsätts, vilket leder till ett försämrat utbyte. Om föreningen är färgad ska sköljningen vara helt klar.
14) Skölj provbehållaren med lite lösningsmedel (eller diklormetan om sådan används, fig. 7 c) och tillsätt sköljningen till kolonnen med samma pipett (för att även skölja pipetten).
15) Öppna stoppkranen och låt vätskan droppa ut tills provet har passerat sandlagret (fig. 7 d) och hamnat i det vita området på kolonnen (använd lufttryck om detta tar mer än 20 sekunder).
16) Skölj försiktigt kolonnens sidor med en virvlande rörelse och använd 1-2 pipetter fulla med elueringsvätska för att skölja bort eventuellt stänkt prov. Låt vätskan droppa ut igen (eller använd lufttryck) tills provet trycks in i den vita adsorbenten.
Upprepa sköljningssteget tills du känner dig säker på att hela provet har placerats på adsorbenten. Om en del av provet fortfarande finns kvar i sandlagret kan det lösas upp i eluenten när mer lösningsmedel tillsätts, vilket leder till ett försämrat utbyte. Om föreningen är färgad ska sköljningen vara helt klar.
a och b) Fyllning av lösningsmedelsbehållaren, c och d) Utsköljning av kolonnen
Fyll på med elueringsvätska ocheluera kolonnen
17) Tillsätt försiktigt mer elueringsmedel med pipetten (fig. 8 a), virvla ner längs sidorna och häll sedan försiktigt i större mängder (fig. 8 b) av det beredda elueringsmedlet för att fylla behållaren (eller fyll på så mycket som behövs) när sandlagret inte längre störs av tillskotten. Ren elueringsvätska som samlats upp under packningen av kolonnen kan återanvändas.
18) Använd lufttryck för att försiktigt och stadigt eluera provet genom kolonnen (fig. 8 c och d). Ju fler gånger trycket startas och stoppas, desto mer sannolikt är det att kolonnen spricker. Det är bäst om trycket kan hållas mjukt och stadigt hela tiden.
Den optimala dropphastigheten under elueringen beror på kolonnens storlek. Det ideala elueringsflödet är när lösningsmedlet i den cylindriska delen av kolonnen ovanför adsorbenten sjunker med 5 cm per minut. Därför bör dropphastigheten vara långsammare med en smal kolonn jämfört med en bredare kolonn. Dropphastigheten för en en tum lång kolonn bör vara så hög att enskilda droppar knappt kan urskiljas. En vätskeström som rinner ut ur stoppkranen med en kolonn av den här storleken är något för snabb.
18) Använd lufttryck för att försiktigt och stadigt eluera provet genom kolonnen (fig. 8 c och d). Ju fler gånger trycket startas och stoppas, desto mer sannolikt är det att kolonnen spricker. Det är bäst om trycket kan hållas mjukt och stadigt hela tiden.
Den optimala dropphastigheten under elueringen beror på kolonnens storlek. Det ideala elueringsflödet är när lösningsmedlet i den cylindriska delen av kolonnen ovanför adsorbenten sjunker med 5 cm per minut. Därför bör dropphastigheten vara långsammare med en smal kolonn jämfört med en bredare kolonn. Dropphastigheten för en en tum lång kolonn bör vara så hög att enskilda droppar knappt kan urskiljas. En vätskeström som rinner ut ur stoppkranen med en kolonn av den här storleken är något för snabb.
a-c) Uppsamling av fraktioner, d) Körning av en kolonn
Samla uppfraktioner
19) Börja omedelbart samla upp den eluerande vätskan i provrör på ett ställ (Fig.9 a). Se Fig.1 för rekommendationer om vilka volymer som ska samlas upp i varje provrör.20) När det första provröret fylls, eller om en viss mängd vätska har samlats upp enligt rekommendation från din lärare eller Fig.1, flyttar du ställningen för att börja samla upp vätskan i ett annat rör (Fig.9 b och c). Fyll rören och håll dem i ordning på stället.
Dessa olika rör kallas "fraktioner". Målet med en kolonn är att samla in tillräckligt små fraktioner för att de flesta (eller vissa) fraktioner ska innehålla rent material. Om det är svårt att separera blandningen (om komponenternas ΔRf är lågt) kan det vara bäst att samla in små fraktioner (t.ex. halvfyllda rör).
Dessa olika rör kallas "fraktioner". Målet med en kolonn är att samla in tillräckligt små fraktioner för att de flesta (eller vissa) fraktioner ska innehålla rent material. Om det är svårt att separera blandningen (om komponenternas ΔRf är lågt) kan det vara bäst att samla in små fraktioner (t.ex. halvfyllda rör).
a-c) Sköljmaterial som stänkt på kolonnens spets, d) Studenter som kör en kolonn
21) När vätska dräneras från kolonnen stänker den ofta på utsidan av kolonnspetsen, och när lösningsmedlet avdunstar kan du se en ring av material på spetsen (du ser en ring av fast material om komponenten är fast som i Fig.10 b, eller oljedroppar om komponenten är flytande). Om komponenterna är färgade ska kolonnspetsen sköljas (fig.10 c) när det verkar som om en komponent har eluerats helt och innan den andra komponenten kommer.
22) Håll regelbundet ett öga på eluentnivån och fyll på den innan den sjunker under sandlagret.
22) Håll regelbundet ett öga på eluentnivån och fyll på den innan den sjunker under sandlagret.
a) Eluering, b) Tillsats av etylacetat för att öka lösningsmedlets polaritet, c) Lösningsmedelsnivån närmar sig sandlagret, d) Påfyllning
Möjligen öka lösningsmedlets polaritet
23) En elueringsvätska kan användas genom hela kolonnen, särskilt om de komponenter som ska separeras har liknande Rf-värden. Om komponenterna däremot har mycket olika Rf-värden kan lösningsmedlets polaritet ökas efter att en komponent har eluerats från kolonnen (fig. 11 a).
Om lösningsmedlets polaritet ökas kommer komponenterna att transporteras "snabbare". Det finns flera skäl till att en snabbare eluering är önskvärd. För det första, om en komponent redan har lämnat kolonnen har kolonnen redan gjort sitt jobb med separationen, så att påskynda processen kommer inte att påverka renheten hos de insamlade fraktionerna. För det andra, ju längre tid det tar att köra en kolonn, desto bredare blir komponentbanden (på grund av diffusion), och att samla in ett brett band av material kommer att använda (och slösa) mycket lösningsmedel.
Om lösningsmedlets polaritet ökas kommer komponenterna att transporteras "snabbare". Det finns flera skäl till att en snabbare eluering är önskvärd. För det första, om en komponent redan har lämnat kolonnen har kolonnen redan gjort sitt jobb med separationen, så att påskynda processen kommer inte att påverka renheten hos de insamlade fraktionerna. För det andra, ju längre tid det tar att köra en kolonn, desto bredare blir komponentbanden (på grund av diffusion), och att samla in ett brett band av material kommer att använda (och slösa) mycket lösningsmedel.
Innehåller en partiell lista över den eluotropiska serien, en lista över vanliga lösningsmedel rangordnade efter deras "lösningsmedelsstyrka" i normalfasskromatografi. Det mer polära lösningsmedlet orsakar den mest dramatiska ökningen av Rf
24) För att öka lösningsmedlets polaritet kan det polära lösningsmedlet droppas direkt i eluenten på kolonnbehållaren (fig. 11 b). Om man t.ex. använder en blandning av hexan och etylacetat kan man genom att tillsätta ren etylacetat till eluenten i behållaren öka dess polaritet. Om eluentnivån börjar bli låg kan man bereda en lösning som innehåller en högre procentandel av den mer polära komponenten. Om kolonnen t.ex. först använde en blandning av hexan och etylacetat i förhållandet 4:1, skulle en blandning i förhållandet 1:1 vara ett mer polärt lösningsmedel.
25 ) Eluera kolonnen med det mer polära lösningsmedlet som tidigare och kom alltid ihåg att hålla koll på elueringsnivån och fyll på (fig.11 d) innan den sjunker under sandlagret.
26) För att öka lösningsmedlets polaritet kan det polära lösningsmedlet droppas direkt i elueringsmedlet på kolonnens behållare (fig. 11 b). Om man t.ex. använder en blandning av hexan och etylacetat kan man genom att tillsätta ren etylacetat till eluenten i behållaren öka dess polaritet. Om eluentnivån börjar bli låg kan man bereda en lösning som innehåller en högre procentandel av den mer polära komponenten. Om kolonnen t.ex. först använde en blandning av hexan och etylacetat i förhållandet 4:1, skulle en blandning i förhållandet 1:1 vara ett mer polärt lösningsmedel.
27) Eluera kolonnen med det mer polära lösningsmedlet som tidigare och kom alltid ihåg att hålla koll på elueringsnivån och fyll på (fig.11 d) innan den sjunker under sandlagret.
25 ) Eluera kolonnen med det mer polära lösningsmedlet som tidigare och kom alltid ihåg att hålla koll på elueringsnivån och fyll på (fig.11 d) innan den sjunker under sandlagret.
26) För att öka lösningsmedlets polaritet kan det polära lösningsmedlet droppas direkt i elueringsmedlet på kolonnens behållare (fig. 11 b). Om man t.ex. använder en blandning av hexan och etylacetat kan man genom att tillsätta ren etylacetat till eluenten i behållaren öka dess polaritet. Om eluentnivån börjar bli låg kan man bereda en lösning som innehåller en högre procentandel av den mer polära komponenten. Om kolonnen t.ex. först använde en blandning av hexan och etylacetat i förhållandet 4:1, skulle en blandning i förhållandet 1:1 vara ett mer polärt lösningsmedel.
27) Eluera kolonnen med det mer polära lösningsmedlet som tidigare och kom alltid ihåg att hålla koll på elueringsnivån och fyll på (fig.11 d) innan den sjunker under sandlagret.
a) Original TLC-platta, b) Fraktioner som samlats in av kolonnen, c) Spotting av fraktioner på en TLC-platta, d) En visualiserad TLC-platta med prover av varje fraktion
Hitta ochkoncentrera den önskade komponenten
28) För att hitta den önskade komponenten i provrörsfraktionerna är det bra att förstå förhållandet mellan Rf och elueringsordning i kolonnkromatografi.Vid kolonnkromatografi deponeras provet längst fram i kolonnen och elueras nedåt, medan provet vid tunnskiktskromatografi placeras på botten av plattan och elueras uppåt. Därför kan en kolonn betraktas som en upp-och-nedvänd TLC-platta. En förening med högre Rf löper "snabbare", vilket innebär att den hamnar högre upp på TLC-plattan och samlas upp först med en kolonn. I kolonnen som visas på bilden i detta avsnitt är komponenten med lägre Rf (orange på TLC-plattan i Fig. 13 a) den komponent som samlas upp som nummer två från kolonnen.
29) Bestäm först vilka provrör som innehåller upplöst förening.
29) Bestäm först vilka provrör som innehåller upplöst förening.
a) Spotta ett prov av varje fraktion på en TLC-platta märkt med fraktionsnummer som motsvarar den ordning i vilken de samlades in (fig. 13 c). Det kan vara bäst att spotta varje prov 2-3 gånger ovanpå varandra ifall fraktionerna är utspädda.
b) Om många fraktioner har samlats in och du därför tvekar att ta prov på varje fraktion, är en metod för att identifiera färglösa fraktioner som kan innehålla förening att leta efter en antydan till rest som leder provrören. Efter avdunstning finns det ibland en fast rest (fig. 13) eller oljedroppar kvar på toppen av provröret, vilket gör det uppenbart att dessa fraktioner innehåller mer än bara lösningsmedel. Ta prov på alla fraktioner nära de rör som innehåller synliga rester.
c) Visualisera den fläckiga TLC-plattan med UV-ljus och/eller en färgning för att avgöra vilka fraktioner som innehåller förening (fig. 13 d)
Bild
a) Eluerade TLC-plattor av fraktioner som innehåller möjlig förening, b) Kombination av fraktioner, c) Sköljning av ett fraktionsrör
a) Eluerade TLC-plattor av fraktioner som innehåller möjlig förening, b) Kombination av fraktioner, c) Sköljning av ett fraktionsrör
28) Gör en TLC av alla fraktioner som innehåller förening, med upp till fem prover per 2,5 cm bred TLC-platta. Bredare TLC-plattor kan användas för detta ändamål om sådana finns tillgängliga.
29) Identifiera föreningen med önskad Rf genom att jämföra med den ursprungliga TLC-plattan med råmaterial. Välj att behålla de fraktioner som har den önskade föreningen i ren form, vilket framgår av den eluerade TLC-plattan. Om t.ex. föreningen med högre Rf önskas i fig. 15 a, bör fraktionerna 6-10 behållas.
30) Blanda de rena fraktionerna i en rundbottnad kolv av lämplig storlek (högst halvfull, fig. 15 b). Skölj varje provrör med en liten mängd eluent (eller annat lösningsmedel om löslighet är ett problem) och tillsätt sköljningen till den rundbottnade kolven (fig. 15 c).
31) Indunsta lösningsmedlet på den roterande indunstaren så att den renade föreningen blir kvar i kolven.
29) Identifiera föreningen med önskad Rf genom att jämföra med den ursprungliga TLC-plattan med råmaterial. Välj att behålla de fraktioner som har den önskade föreningen i ren form, vilket framgår av den eluerade TLC-plattan. Om t.ex. föreningen med högre Rf önskas i fig. 15 a, bör fraktionerna 6-10 behållas.
30) Blanda de rena fraktionerna i en rundbottnad kolv av lämplig storlek (högst halvfull, fig. 15 b). Skölj varje provrör med en liten mängd eluent (eller annat lösningsmedel om löslighet är ett problem) och tillsätt sköljningen till den rundbottnade kolven (fig. 15 c).
31) Indunsta lösningsmedlet på den roterande indunstaren så att den renade föreningen blir kvar i kolven.
a) Använd lufttryck för att torka kolonnen, b) Låt kolonnen torka upp och ner, c) Samla upp kiseldioxidavfallet
Rengöring avkolonnen
32) För att torka kolonnen, använd lufttryck för att tömma majoriteten av eluenten från kolonnen till en avfallsbehållare. Torka sedan kolonnen ytterligare med hjälp av någon av följande metoder.
a) Låt en svag luftström rinna genom kolonnen för att torka den ytterligare medan du städar upp andra saker (fig.16 a).
b) Kläm fast kolonnen upp och ner över en stor avfallsbägare i dragskåpet, så att adsorbenten faller ner när den har torkat (fig.16 b). Detta kommer att ta lång tid (till nästa lektion), men är ett alternativ.
33) När adsorbenten är torr kan den hällas ut ur kolonnen och läggas i en avfallsbehållare i dragskåpet (fig.16 c).
Säkerhetsanmärkning: Adsorbenter i pulverform är irriterande för lungorna, och risken förvärras om kolonnen innehåller rester av föreningar som nu kan ta sig ner i lungorna. Hällning av kiseldioxid- eller aluminiumoxidpulver ska alltid göras i dragskåpet.
34) När merparten av adsorbenten har samlats upp i en avfallsbehållare ska du använda vatten för att skölja bort eventuellt kvarvarande fast material i diskhon och sedan skölja kolonnen med aceton i en avfallsbägare. Rengör sedan kolonnen med tvål och vatten och torka den med avstängningskranens delar åtskilda.
Säkerhetsanmärkning: Adsorbenter i pulverform är irriterande för lungorna, och risken förvärras om kolonnen innehåller rester av föreningar som nu kan ta sig ner i lungorna. Hällning av kiseldioxid- eller aluminiumoxidpulver ska alltid göras i dragskåpet.
34) När merparten av adsorbenten har samlats upp i en avfallsbehållare ska du använda vatten för att skölja bort eventuellt kvarvarande fast material i diskhon och sedan skölja kolonnen med aceton i en avfallsbägare. Rengör sedan kolonnen med tvål och vatten och torka den med avstängningskranens delar åtskilda.
Felsökning
Luftbubblor syns i kolonnen
En luftbubbla är en tom ficka där jämvikten mellan stationär och rörlig fas inte sker, så komponenterna rör sig snabbare runt en luftbubbla än de borde. Detta kan leda till ojämna elueringsband, vilket kan orsaka överlappning om separationen av blandningen är svår (om komponenterna har mycket nära Rf-värden, som i Fig.17).
Om du ser luftbubblor i kolonnen och sanden eller provet ännu inte har applicerats ska du skaka om kolonnen ordentligt under packningen för att avlägsna alla luftbubblor. Kontakta din instruktör om bubblorna inte försvinner, eftersom du kanske är för försiktig med uppgiften. Om sanden eller provet redan har applicerats är det bäst att låta kolonnen vara som den är och hoppas att luftbubblorna inte påverkar separationen.
Banden eluerar ojämnt
Om komponenterna i en blandning är färgade kan det vara uppenbart när banden eluerar på ett krokigt sätt. Detta beror troligen på att kolonnen har klämts fast i en lätt diagonal. Om kolonnen är fastspänd på ett snett sätt kommer komponenterna att färdas på ett snett sätt (fig. 18). Detta kan orsaka separationsproblem om komponenterna har liknande Rf.
are på separationen
Det finns inget sätt att lösa detta problem mitt i en kolonn, men om komponenterna har mycket olika Rf-värden kanske de sneda banden inte har någon effekt på separationen. I framtiden bör du kontrollera att kolonnen är helt vertikal i både sidled och framifrån och bakåt.
Last edited by a moderator:
