Uvod
Kolonska kromatografija je razširitev tankoplastne kromatografije (TLC). Predpostavlja se, da ima bralec že nekaj izkušenj iz laboratorijske prakse in da se je že srečal s tankoslojno kromatografijo. Namesto nanosa vzorca na tanko plast silicijevega ali aluminijevega oksida se vzorec nanese na valj z adsorbentom, topilo pa se nenehno pritiska, dokler se sestavine popolnoma ne izcedijo iz valja. S to modifikacijo je mogoče komponente ne le ločiti, temveč tudi zbirati v različnih posodah, kar omogoča prečiščevanje mešanic in ločevanje zdravil z onesnaženji. Kolonska kromatografija (znana tudi kot "bliskovna kromatografija") se pogosto uporablja v raziskovalnih okoljih, kar dokazuje njeno pogosto pojavljanje v postopkovnih poglavjih člankov v revijah.
Postopkovna razprava
Za kolono kromatografijo veljajo enaka temeljna načela kot za tankoplastno kromatografijo (TLC). Pravzaprav se pred izvedbo kolone vedno izvede TLC, da se oceni stanje in določi ustrezno razmerje topil. Za dobro ločevanje je idealno, če ima želena komponenta Rf okoli 0,35 (preberite o Rf v temi TLC) in je od drugih komponent ločena za vsaj 0,2 enote Rf. Če sta ločevalni točki zelo blizu (če je razlika v Rf < 0,2), je najbolje, če ima sredina točk Rf 0,35. Rf blizu 0,35 je idealen, ker je dovolj počasen, da lahko pride do izravnave med stacionarno in mobilno fazo, hkrati pa dovolj hiter, da se čim bolj zmanjša širjenje pasu zaradi difuzije.
Obstaja nekaj spremenljivk, ki ne veljajo za TLC, vendar vplivajo na ločevanje komponent v kolonski kromatografiji. Te vključujejo premer kolone, količino uporabljenega adsorbenta in hitrost pretoka topila. Slika. 1 prikazuje priporočila za spremenljivke glede na velikost vzorca in stopnjo ločevanja komponent. V vseh scenarijih je treba kolone pripraviti v višini med 12,5 in 15 cm.
Obstaja nekaj spremenljivk, ki ne veljajo za TLC, vendar vplivajo na ločevanje komponent v kolonski kromatografiji. Te vključujejo premer kolone, količino uporabljenega adsorbenta in hitrost pretoka topila. Slika. 1 prikazuje priporočila za spremenljivke glede na velikost vzorca in stopnjo ločevanja komponent. V vseh scenarijih je treba kolone pripraviti v višini med 12,5 in 15 cm.
Na primer, s kolono, veliko 2,5 cm, je treba očistiti približno 400 mg snovi, če je ločevanje dobro (ΔRf > 0,2, tretji stolpec na sliki 1), ali približno 160 mg, če je ločevanje težavno (ΔRf > 0,1). Kolono je treba pripraviti in eluirati s približno 200 ml topila, frakcije pa je mogoče zbrati s približno 10 ml raztopine za vsako.
Obstaja več različic, kako fizično voditi kolono. Ena od velikih razlik v metodah je način priprave kolone. Pri metodi "suhega pakiranja" se suhi silicijev dioksid ali aluminijev oksid doda neposredno v kolono, topilo pa se skozi njo pretaka po delih, nato pa s pritiskom. Pri metodi "mokrega pakiranja" se kolona najprej napolni s topilom, nato se suhi silicijev dioksid ali aluminijev oksid rahlo strese, nato pa se pakira s pritiskom. Pri metodi "mulja" se silicijevemu dioksidu ali aluminijevemu oksidu v Erlenmeyerjevi bučki doda topilo, ki se v obliki mulja zlije na kolono, nato pa se zapakira s tlakom (tlak se lahko doseže z brizgalko).
Pomembno je vedeti, da se pri dodajanju topila silicijevemu dioksidu ali aluminijevemu oksidu sprošča toplota (imata eksotermno solvatacijsko toploto). V tem razdelku je predstavljena metoda z raztopino, pri čemer je glavni razlog, da ta eksotermna faza poteka v Erlenmeyerjevi bučki in ne na koloni. Če se toplota sprosti med polnjenjem kolone, lahko zaradi vrenja topila nastanejo mehurčki. Ti lahko motijo ločevanje kolone, če niso ustrezno odstranjeni, in lahko razpokajo adsorbcijski material v koloni.
Obstaja več različic, kako fizično voditi kolono. Ena od velikih razlik v metodah je način priprave kolone. Pri metodi "suhega pakiranja" se suhi silicijev dioksid ali aluminijev oksid doda neposredno v kolono, topilo pa se skozi njo pretaka po delih, nato pa s pritiskom. Pri metodi "mokrega pakiranja" se kolona najprej napolni s topilom, nato se suhi silicijev dioksid ali aluminijev oksid rahlo strese, nato pa se pakira s pritiskom. Pri metodi "mulja" se silicijevemu dioksidu ali aluminijevemu oksidu v Erlenmeyerjevi bučki doda topilo, ki se v obliki mulja zlije na kolono, nato pa se zapakira s tlakom (tlak se lahko doseže z brizgalko).
Pomembno je vedeti, da se pri dodajanju topila silicijevemu dioksidu ali aluminijevemu oksidu sprošča toplota (imata eksotermno solvatacijsko toploto). V tem razdelku je predstavljena metoda z raztopino, pri čemer je glavni razlog, da ta eksotermna faza poteka v Erlenmeyerjevi bučki in ne na koloni. Če se toplota sprosti med polnjenjem kolone, lahko zaradi vrenja topila nastanejo mehurčki. Ti lahko motijo ločevanje kolone, če niso ustrezno odstranjeni, in lahko razpokajo adsorbcijski material v koloni.
Postopki po korakih
a ) TLC mešanice ferocena/acetilferrocena, b ) Kolonska kromatografija
Kolona, prikazana v tem delu, prikazuje čiščenje 0,20 g vzorca, ki vsebuje mešanico ferocena in acetilferrocena (surovi TLC je na sliki 2 a). V majhne epruvete smo zbrali približno 8 ml frakcij in uporabili približno 400 ml eluenta.
a) TLC plošča mešanice surovega ferocena/acetilferocena pred elucijo, b ) po eluciji, c ) kolona s frito, d ) kolona z bombažnim klinom na dnu, e) kolona brez bombažnega klina (pred uporabo bi ga bilo treba vstaviti)
Izvedite TLC
1 ) Izvedite TLC na vzorcu za čiščenje (sliki 3 a in b), da določite ustrezno topilo za kromatografijo. Želena komponenta mora imeti Rf okoli 0,35 in mora biti v idealnem primeru ločena od vseh drugih lis za vsaj 0,2 enote Rf.
2 ) Pripravite serijo eluenta, ki daje ustrezno vrednost Rf. Pripravljena količina je odvisna od količine vzorca, velikosti kolone in od tega, ali je načrtovana sprememba sestave topila na sredini poti. (Za smernice glejte sliko 1, za trende v "moči topila" pa eluotropno serijo).
2 ) Pripravite serijo eluenta, ki daje ustrezno vrednost Rf. Pripravljena količina je odvisna od količine vzorca, velikosti kolone in od tega, ali je načrtovana sprememba sestave topila na sredini poti. (Za smernice glejte sliko 1, za trende v "moči topila" pa eluotropno serijo).
Priprava pakirane kolone
3 ) Pridobite ustrezno kolono (glejte Sliko 1) in se prepričajte, da je v bližini zaporne pipe nekaj, kar bo omogočilo prehod tekočine, ne pa tudi trdne snovi. Kolone imajo lahko sintran disk (znan tudi kot "frita"), slika 3 c), ali zamašek iz vate ali steklene volne, ki je ostal od prejšnjega uporabnika (slika 3 d). Če diska ali čepka ni (slika 3 e), v dno kolone z dolgo palico vtaknite majhen kos vate ali steklene volne.
a) Nalivanje silicijevega dioksida do višine 12,5-15 cm v digestoriju, b ) nalivanje silicijevega dioksida v Erlenmeyerjevo bučko, c in d) izdelava suspenzije
Varnostno opozorilo: Prašek silicijevega dioksida in aluminijevega oksida draži pljuča, zato je treba z njim v digestoriju vedno ravnati previdno. Raztresenega prahu se znebite tako, da ga pobrišete z mokro papirnato brisačo (če je mokra, so drobni delci manj razpršeni).
5 ) V digestoriju prelijte adsorbent, izmerjen v koloni, v Erlenmeyerjevo bučko (slika 4 b), nato dodajte nekaj eluenta (slika 4 c). Naredite rahlo suspenzijo z vrtenjem in mešanjem s stekleno mešalno palico (slika 4 d), dokler se ves adsorbent popolnoma ne navlaži, plinski mehurčki se sprostijo in je konsistenca nekoliko gosta, vendar tekoča.
Slika
a ) Nalivanje suspenzije v kolono, b) Izpiranje bučke, c ) Adsorbent, prilepljen na stranice kolone, d) Izpiranje prilepljenega adsorbenta
a ) Nalivanje suspenzije v kolono, b) Izpiranje bučke, c ) Adsorbent, prilepljen na stranice kolone, d) Izpiranje prilepljenega adsorbenta
6 ) Pod vpeto kolono postavimo čašo ali Erlenmeyerjevo bučko in odpremo zamašek. V enem hitrem gibu zavrtite in z lijakom z velikim ustjem vlijte kremenčevo ali aluminijevo kašo v kolono (slika 5 a). Takoj uporabite več eluenta, da iz Erlenmeyerjeve bučke (slika 5 b) izperete preostalo gnojevko na kolono.
7) Z eluentom in vrtinčastim gibanjem Pasteurjeve pipete takoj izperite morebitni silicijev dioksid ali aluminijev oksid s strani rezervoarja kolone (sliki 5 c in d). Če pustite, da se adsorbent posuši, se bo oprijel stekla in ga ne bo mogoče zlahka sprati.
7) Z eluentom in vrtinčastim gibanjem Pasteurjeve pipete takoj izperite morebitni silicijev dioksid ali aluminijev oksid s strani rezervoarja kolone (sliki 5 c in d). Če pustite, da se adsorbent posuši, se bo oprijel stekla in ga ne bo mogoče zlahka sprati.
Slika
a ) Potiskanje stolpca za odstranjevanje zračnih mehurčkov, b ) uporaba zračnega tlaka, c ) dodajanje peska, d) izpiranje peska s strani
a ) Potiskanje stolpca za odstranjevanje zračnih mehurčkov, b ) uporaba zračnega tlaka, c ) dodajanje peska, d) izpiranje peska s strani
8) Stolpec močno potresite s plutovinastim obročem ali z brki (slika 6 a), da odstranite morebitne zračne mehurčke v stolpcu (ki bi lahko povzročili slabo ločitev ali razpokanje adsorbenta v stolpcu) in spodbudite enakomerno odlaganje adsorbenta.
9) Z rahlim pritiskom zraka na vrh kolone (slika 6 b) jo stisnite in prenehajte, ko je raven eluenta 1 cm od vrha kolone. Če se z zračno cevjo uporablja T-nastavek, kot je prikazano na sliki 6 b, je mogoče fino uravnavati pretok zraka z nastavitvijo ščipalne sponke na gumijasti cevi. Med celotnim postopkom elucije naj bo beli stolpec adsorbenta moker, raven eluenta pa naj bo nad vrhom silicijevega ali aluminijevega oksida. Nežno pretrgajte tesnilo, da prenehate izvajati pritisk, in zaprite zaporno pipo, da preprečite nadaljnje kapljanje tekočine.
10 ) Dodajte tanko plast peska (slika 6 c), približno 0,5 cm visoko. Stranice kolone sperite z eluentom z vrtinčastim gibanjem, da se pesek odlepi od stranic stekla (slika 6 d). Odprite zaporno pipo in pustite, da tekočina kaplja ven, dokler ni tik nad plastjo peska. Če je kapljanje prepočasno, uporabite zračni tlak.
9) Z rahlim pritiskom zraka na vrh kolone (slika 6 b) jo stisnite in prenehajte, ko je raven eluenta 1 cm od vrha kolone. Če se z zračno cevjo uporablja T-nastavek, kot je prikazano na sliki 6 b, je mogoče fino uravnavati pretok zraka z nastavitvijo ščipalne sponke na gumijasti cevi. Med celotnim postopkom elucije naj bo beli stolpec adsorbenta moker, raven eluenta pa naj bo nad vrhom silicijevega ali aluminijevega oksida. Nežno pretrgajte tesnilo, da prenehate izvajati pritisk, in zaprite zaporno pipo, da preprečite nadaljnje kapljanje tekočine.
10 ) Dodajte tanko plast peska (slika 6 c), približno 0,5 cm visoko. Stranice kolone sperite z eluentom z vrtinčastim gibanjem, da se pesek odlepi od stranic stekla (slika 6 d). Odprite zaporno pipo in pustite, da tekočina kaplja ven, dokler ni tik nad plastjo peska. Če je kapljanje prepočasno, uporabite zračni tlak.
Dodajte vzorec
Ko je vzorec nanesen na kolono, se začne tekmovanje s časom, saj bo difuzija začela širiti snov. Vzorca ne smete nanesti, dokler niste pripravljeni takoj in v celoti dokončati kolone. Ta postopek lahko traja od 15 do 90 minut! Če za zbiranje frakcij uporabljate epruvete, jih je treba pred dodajanjem vzorca postaviti v stojalo, višino kolone pa prilagoditi tako, da lahko stojalo za epruvete zdrsne pod njo.
Slika
a ) Raztapljanje trdne snovi z majhno količino diklorometana, b ) nanašanje vzorca, c ) izpiranje vzorca v erlenmajerici, d) pritiskanje, da se vzorec potisne na kolono tik za plastjo peska
a ) Raztapljanje trdne snovi z majhno količino diklorometana, b ) nanašanje vzorca, c ) izpiranje vzorca v erlenmajerici, d) pritiskanje, da se vzorec potisne na kolono tik za plastjo peska
11) Če je surovi vzorec tekočina, ga uporabite neposredno (pojdite na korak 13).
12 ) Če je surovi vzorec trdna snov, naredite eno od naslednjih dejanj.
12 ) Če je surovi vzorec trdna snov, naredite eno od naslednjih dejanj.
a ) Idealna situacija: trdno snov raztopite v najmanjši količini eluenta (največ nekaj ml).
b ) Če trdna snov ni posebej topna ali se ne raztopi v nekaj ml eluenta, jo raztopite v najmanjši količini diklorometana (največ nekaj ml, slika 7 a).
c) Če trdna snov ni topna v eluentu, je možen tudi alternativni postopek. Trdno snov raztopimo v bučki z okroglim dnom z nekaj ml topila z nizkim vreliščem (npr. diklorometana ali acetona). V erlenmajerico dodamo približno 1 g silicijevega dioksida ali aluminijevega oksida, nato pa topilo odstranimo na rotacijskem uparjalniku, da ostane trdna snov, ki vsebuje vzorec, nanesen na adsorbent. Ko je na vrhu napolnjene kolone en centimeter eluenta (če uporabljate to metodo, preskočite dodajanje plasti peska), z lijakom s širokim ustjem vlijte vzorec, adsorbiran na silicijev dioksid, na kolono. Če se na steklo prilepi prah, ga sperite z več eluenta (nadaljujte s korakom 15).
13) Previdno dodajte vzorec v kolono s pipeto, pri čemer tekočino ali raztopino s konico pipete kapljajte neposredno na pesek čim bližje, ne po straneh (slika 7 b). Pazite, da tekočine ne brizgnete na silo, tako da bi nastale vdolbine v pesku ali stolpcu iz silicijevega dioksida/alumina.
14) Posodo za vzorec sperite z malo topila (ali diklorometana, če ga uporabljate, slika 7 c) in z isto pipeto (da sperete tudi pipeto) dodajte izpiranje v kolono.
15) Odprite zaporno pipo in pustite, da tekočina kaplja, dokler vzorec ne pride tik za plast peska (slika 7 d) in v belo območje kolone (uporabite zračni tlak, če to traja več kot 20 sekund).
16) Z vrtinčastim gibanjem nežno sperite stranice kolone z 1-2 pipetami, polnimi eluenta, da sperete morebitni razpršeni vzorec. Ponovno pustite, da tekočina kaplja ven (ali uporabite zračni tlak), dokler se vzorec ne potisne v beli adsorbent.
Korak izpiranja ponavljajte, dokler niste prepričani, da je celoten vzorec nanesen na adsorbent. Če je nekaj vzorca še vedno v plasti peska, se lahko ob dodajanju več topila raztopi v eluentu, kar povzroči izgubo izkoristka. Če je spojina obarvana, mora biti izpiranje popolnoma jasno.
14) Posodo za vzorec sperite z malo topila (ali diklorometana, če ga uporabljate, slika 7 c) in z isto pipeto (da sperete tudi pipeto) dodajte izpiranje v kolono.
15) Odprite zaporno pipo in pustite, da tekočina kaplja, dokler vzorec ne pride tik za plast peska (slika 7 d) in v belo območje kolone (uporabite zračni tlak, če to traja več kot 20 sekund).
16) Z vrtinčastim gibanjem nežno sperite stranice kolone z 1-2 pipetami, polnimi eluenta, da sperete morebitni razpršeni vzorec. Ponovno pustite, da tekočina kaplja ven (ali uporabite zračni tlak), dokler se vzorec ne potisne v beli adsorbent.
Korak izpiranja ponavljajte, dokler niste prepričani, da je celoten vzorec nanesen na adsorbent. Če je nekaj vzorca še vedno v plasti peska, se lahko ob dodajanju več topila raztopi v eluentu, kar povzroči izgubo izkoristka. Če je spojina obarvana, mora biti izpiranje popolnoma jasno.
Slika
a in b) polnjenje rezervoarja s topilom, c in d) izpiranje kolone
a in b) polnjenje rezervoarja s topilom, c in d) izpiranje kolone
Napolnite raztopino in izločite kolono
17) Previdno dodajte več eluenta s pipeto (slika 8 a), obračajte po straneh, in ko z dodajanjem ne bi več motili plasti peska, previdno vlijte večje količine (slika 8 b) pripravljenega eluenta, da napolnite rezervoar (ali pa ga napolnite toliko, kolikor bo potrebno). Čisti eluent, zbran med polnjenjem kolone, se lahko ponovno uporabi.
18 ) S pritiskom zraka nežno in enakomerno eluirajte vzorec skozi kolono (sliki 8 c in d). Večkrat ko se tlak sproži in ustavi, večja je verjetnost, da bo kolona počila. Najbolje je, če lahko tlak ves čas vzdržujete nežno in enakomerno.
Optimalna hitrost kapljanja med elucijo je odvisna od velikosti kolone. Idealen pretok eluenta je, ko topilo v valjastem delu kolone nad adsorbentom kaplja s hitrostjo 5 cm na minuto. Zato mora biti hitrost kapljanja počasnejša pri ozki koloni v primerjavi s širšo kolono. Hitrost kapljanja pri enocentimetrski koloni mora biti takšna, da se posamezne kapljice komaj ločijo. Potok tekočine, ki se izliva iz zaporne pipe pri tej velikosti kolone, je nekoliko prehiter.
18 ) S pritiskom zraka nežno in enakomerno eluirajte vzorec skozi kolono (sliki 8 c in d). Večkrat ko se tlak sproži in ustavi, večja je verjetnost, da bo kolona počila. Najbolje je, če lahko tlak ves čas vzdržujete nežno in enakomerno.
Optimalna hitrost kapljanja med elucijo je odvisna od velikosti kolone. Idealen pretok eluenta je, ko topilo v valjastem delu kolone nad adsorbentom kaplja s hitrostjo 5 cm na minuto. Zato mora biti hitrost kapljanja počasnejša pri ozki koloni v primerjavi s širšo kolono. Hitrost kapljanja pri enocentimetrski koloni mora biti takšna, da se posamezne kapljice komaj ločijo. Potok tekočine, ki se izliva iz zaporne pipe pri tej velikosti kolone, je nekoliko prehiter.
Slika
a-c) Zbiranje frakcij, d ) Vodenje kolone
a-c) Zbiranje frakcij, d ) Vodenje kolone
Zbiranje frakcij
19 ) Takoj začnite zbirati elucijsko tekočino v epruvete na stojalu (slika 9 a). Glej Sliko 1 za priporočila glede volumnov, ki jih je treba zbrati v posamezni epruveti.20) Ko se prva epruveta napolni ali če je bila zbrana določena višina tekočine, kot priporoča vaš inštruktor ali slika 1, premaknite stojalo in začnite zbirati v drugo epruveto (sliki 9 b in c). Epruvete napolnite in jih na stojalu hranite v zaporedju.
Te različne epruvete se imenujejo "frakcije". Cilj kolone je zbrati dovolj majhne frakcije, da večina (ali nekatere) frakcije vsebujejo čisto snov. Če je ločevanje mešanice težavno (če je ΔRf sestavin nizek), je morda najbolje zbrati majhne frakcije (npr. do polovice napolnjene epruvete).
Te različne epruvete se imenujejo "frakcije". Cilj kolone je zbrati dovolj majhne frakcije, da večina (ali nekatere) frakcije vsebujejo čisto snov. Če je ločevanje mešanice težavno (če je ΔRf sestavin nizek), je morda najbolje zbrati majhne frakcije (npr. do polovice napolnjene epruvete).
Slika
a-c) material za izpiranje, ki je brizgnil na konico kolone, d) učenci, ki vodijo kolono
a-c) material za izpiranje, ki je brizgnil na konico kolone, d) učenci, ki vodijo kolono
21) Ko tekočina odteka iz kolone, pogosto brizgne na zunanjo stran konice kolone, in ko topilo izhlapi, lahko na konici vidite obroč materiala (če je komponenta trdna, kot na sliki 10 b, boste videli obroč iz trdne snovi, če je komponenta tekoča, pa oljne kapljice). Če sta komponenti obarvani, je treba konico kolone sprati (slika 10 c), ko se zdi, da se je ena komponenta popolnoma eluirala, in preden se približa druga komponenta.
22 ) Občasno spremljajte nivo eluenta in ga ponovno napolnite, preden pade pod plast peska.
22 ) Občasno spremljajte nivo eluenta in ga ponovno napolnite, preden pade pod plast peska.
Slika.
a ) Elucija, b) Dodatek etil acetata za povečanje polarnosti topila, c ) Raven topila se približuje plasti peska, d) Ponovno polnjenje
a ) Elucija, b) Dodatek etil acetata za povečanje polarnosti topila, c ) Raven topila se približuje plasti peska, d) Ponovno polnjenje
Morebitno povečanje polarnosti topila
23) V celotni koloni lahko uporabimo en eluent, zlasti če imajo komponente, ki jih je treba ločiti, podobne vrednosti Rf. Če pa imajo komponente zelo različne vrednosti Rf, se lahko polarnost topila poveča, ko se ena komponenta eluira iz kolone (slika 11 a).
Povečanje polarnosti topila bo povzročilo, da bodo komponente potovale "hitreje". Obstaja več razlogov, zakaj je zaželeno hitrejše eluiranje. Prvič, če je ena komponenta že izstopila iz kolone, je kolona že opravila svoje delo pri ločevanju, zato pospešitev postopka ne bo vplivala na čistost zbranih frakcij. Drugič, dlje kot traja delovanje kolone, širši bodo pasovi komponent (zaradi difuzije), pri zbiranju širokega pasu snovi pa se porabi (in zavrže) veliko topila.
Povečanje polarnosti topila bo povzročilo, da bodo komponente potovale "hitreje". Obstaja več razlogov, zakaj je zaželeno hitrejše eluiranje. Prvič, če je ena komponenta že izstopila iz kolone, je kolona že opravila svoje delo pri ločevanju, zato pospešitev postopka ne bo vplivala na čistost zbranih frakcij. Drugič, dlje kot traja delovanje kolone, širši bodo pasovi komponent (zaradi difuzije), pri zbiranju širokega pasu snovi pa se porabi (in zavrže) veliko topila.
Vsebuje delni seznam eluotropnih serij, seznam običajnih topil, razvrščenih glede na njihovo "moč topila" v normalni fazni kromatografiji. Bolj polarno topilo povzroči najbolj dramatično povečanje Rf
24) Za povečanje polarnosti topila lahko polarno topilo kapljamo neposredno v eluent na rezervoarju kolone (slika 11 b). Če na primer uporabljamo mešanico heksan:etil acetat, bi z dodajanjem čistega etil acetata eluentu, ki je trenutno v rezervoarju, povečali njegovo polarnost. Če je raven eluenta nizka, lahko pripravimo raztopino, ki vsebuje večji odstotek bolj polarne komponente. Če je bila na primer v koloni najprej uporabljena mešanica heksanov in etil acetata v razmerju 4 : 1, bi bilo z uporabo mešanice v razmerju 1 : 1 topilo bolj polarno.
25 ) Kolono eluirajte z bolj polarnim topilom kot prej, pri tem pa ne pozabite vedno paziti na nivo eluenta in ga ponovno napolnite (slika 11 d), preden pade pod plast peska.
26) Za povečanje polarnosti topila lahko polarno topilo kapnemo neposredno v eluent na rezervoarju kolone (slika 11 b). Če na primer uporabljamo mešanico heksan:etil acetat, bi z dodajanjem čistega etil acetata eluentu, ki je trenutno v rezervoarju, povečali njegovo polarnost. Če je raven eluenta nizka, lahko pripravimo raztopino, ki vsebuje večji odstotek bolj polarne komponente. Če je bila na primer v koloni najprej uporabljena mešanica heksanov in etil acetata v razmerju 4 : 1, bi bilo z uporabo mešanice v razmerju 1 : 1 topilo bolj polarno.
27) Kolono eluirajte z bolj polarnim topilom kot prej, pri tem pa ne pozabite vedno paziti na nivo eluenta in ga ponovno napolnite (slika 11 d), preden pade pod plast peska.
25 ) Kolono eluirajte z bolj polarnim topilom kot prej, pri tem pa ne pozabite vedno paziti na nivo eluenta in ga ponovno napolnite (slika 11 d), preden pade pod plast peska.
26) Za povečanje polarnosti topila lahko polarno topilo kapnemo neposredno v eluent na rezervoarju kolone (slika 11 b). Če na primer uporabljamo mešanico heksan:etil acetat, bi z dodajanjem čistega etil acetata eluentu, ki je trenutno v rezervoarju, povečali njegovo polarnost. Če je raven eluenta nizka, lahko pripravimo raztopino, ki vsebuje večji odstotek bolj polarne komponente. Če je bila na primer v koloni najprej uporabljena mešanica heksanov in etil acetata v razmerju 4 : 1, bi bilo z uporabo mešanice v razmerju 1 : 1 topilo bolj polarno.
27) Kolono eluirajte z bolj polarnim topilom kot prej, pri tem pa ne pozabite vedno paziti na nivo eluenta in ga ponovno napolnite (slika 11 d), preden pade pod plast peska.
Slika
a ) Originalna plošča TLC, b ) Frakcije, ki jih je zbrala kolona, c) Frakcije, ki se nanašajo na ploščo TLC, d) Vizualizirana plošča TLC z vzorci vsake frakcije.
a ) Originalna plošča TLC, b ) Frakcije, ki jih je zbrala kolona, c) Frakcije, ki se nanašajo na ploščo TLC, d) Vizualizirana plošča TLC z vzorci vsake frakcije.
Iskanje in koncentriranje želene komponente
28) Pri iskanju želene komponente v frakcijah v epruveti je koristno razumeti razmerje med Rf in vrstnim redom elucije v kolonski kromatografiji.Pri kolonski kromatografiji se vzorec nanese na vodilo kolone in se eluira navzdol, pri tankoslojni kromatografiji pa se vzorec nanese na dno plošče in se eluira navzgor. Zato si lahko kolono predstavljamo kot obrnjeno ploščo TLC. Spojina z višjim Rf teče "hitreje", kar pomeni, da se bo na ploščici TLC znašla višje in bo s kolono zbrana prva. V koloni, prikazani v tem razdelku, je komponenta z nižjim Rf (oranžna na ploščici TLC na sliki 13 a), komponenta, ki se v koloni zbere kot druga.
29) Najprej ugotovite, v katerih epruvetah je raztopljena spojina.
29) Najprej ugotovite, v katerih epruvetah je raztopljena spojina.
a ) Na ploščici TLC, označeni s številkami frakcij, ki ustrezajo vrstnemu redu, v katerem so bile zbrane (slika 13 c), opazujte vzorec vsake frakcije. Morda bo najbolje, da vsak vzorec 2-3-krat nanesete drug na drugega, če so frakcije razredčene.
b) Če je bilo zbranih veliko frakcij, zaradi česar oklevate z vzorčenjem vsake frakcije, je ena od metod za prepoznavanje brezbarvnih frakcij, ki lahko vsebujejo spojino, iskanje sledi ostankov, ki vodijo epruvete. Po izhlapevanju včasih na vrhu epruvete ostane trdni ostanek (slika 13) ali oljne kapljice, zaradi česar je očitno, da te frakcije vsebujejo več kot le topilo. Vzorčite vse frakcije v bližini epruvet, ki vsebujejo vidne ostanke.
c) Vizualizirajte pegasto ploščo TLC z uporabo UV-svetlobe in/ali barvila, da ugotovite, katere frakcije vsebujejo spojino (slika 13 d).
a ) Eluirane TLC plošče frakcij, ki vsebujejo možno spojino, b ) Združevanje frakcij, c ) Izpiranje epruvete s frakcijo
28) Izvedite TLC vseh frakcij, ki vsebujejo spojino, pri čemer na 2,5 cm široko ploščo TLC nanesite do pet vzorcev. Če so na voljo, lahko v ta namen uporabite širše plošče TLC.
29 ) Spojino z želenim Rf določite s primerjavo z izvirno ploščo TLC s surovim vzorcem. Izberite, da obdržite frakcije, ki imajo želeno spojino v čisti obliki, kar dokazuje eluirana plošča TLC. Če je na primer na sliki 15 a želena spojina z višjim Rf, je treba obdržati frakcije 6-10.
30 ) Združite čiste frakcije v primerno veliko bučko z okroglim dnom (ne več kot do polovice napolnjeno, slika 15 b). Vsako epruveto sperite z majhno količino eluenta (ali drugega topila, če je topnost problematična) in dodajte izpiranje v bučko z okroglim dnom (slika 15 c).
31 ) Izparite topilo na rotacijskem uparjalniku, da v erlenmajerici ostane prečiščena spojina.
29 ) Spojino z želenim Rf določite s primerjavo z izvirno ploščo TLC s surovim vzorcem. Izberite, da obdržite frakcije, ki imajo želeno spojino v čisti obliki, kar dokazuje eluirana plošča TLC. Če je na primer na sliki 15 a želena spojina z višjim Rf, je treba obdržati frakcije 6-10.
30 ) Združite čiste frakcije v primerno veliko bučko z okroglim dnom (ne več kot do polovice napolnjeno, slika 15 b). Vsako epruveto sperite z majhno količino eluenta (ali drugega topila, če je topnost problematična) in dodajte izpiranje v bučko z okroglim dnom (slika 15 c).
31 ) Izparite topilo na rotacijskem uparjalniku, da v erlenmajerici ostane prečiščena spojina.
Slika.
a ) Uporaba zračnega tlaka za sušenje kolone, b ) Pustitev kolone, da se suši obrnjena navzdol, c) Zbiranje odpadnega silicijevega dioksida
a ) Uporaba zračnega tlaka za sušenje kolone, b ) Pustitev kolone, da se suši obrnjena navzdol, c) Zbiranje odpadnega silicijevega dioksida
Čiščenje kolone
32) Za sušenje kolone uporabimo zračni tlak, da večino eluenta iz kolone odvedemo v posodo za odpadke. Nato kolono dodatno posušite z eno od naslednjih metod.
a ) Pustite priključen nežen tok zraka, ki teče skozi kolono, da jo dodatno posušite, medtem ko čistite druge stvari (slika 16 a).
b ) Kolono pritrdite z glavo navzdol nad veliko čašo za odpadke v digestoriju, tako da bo adsorbent padel, ko se bo posušil (slika 16 b). To bo trajalo dlje časa (do naslednje šolske ure), vendar je ena od možnosti.
33) Ko je adsorbent suh, ga lahko iz kolone izlijemo v posodo za odpadke v digestoriju (slika 16 c).
Varnostno opozorilo: Adsorbenti v prahu dražijo pljuča, njihova nevarnost pa se še poveča, če kolona vsebuje preostale spojine, ki lahko zdaj pridejo v vaša pljuča. Prelivanje prahu silicijevega dioksida ali aluminijevega oksida je treba vedno opraviti v digestoriju.
34) Ko je večina adsorbenta zbrana v posodi za odpadke, z vodo izperite vse preostale trdne snovi v umivalnik, nato pa sperite kolono z acetonom v čašo za odpadke. Nadalje očistite kolono z milom in vodo ter jo posušite z ločenimi deli zaporne pipe.
Varnostno opozorilo: Adsorbenti v prahu dražijo pljuča, njihova nevarnost pa se še poveča, če kolona vsebuje preostale spojine, ki lahko zdaj pridejo v vaša pljuča. Prelivanje prahu silicijevega dioksida ali aluminijevega oksida je treba vedno opraviti v digestoriju.
34) Ko je večina adsorbenta zbrana v posodi za odpadke, z vodo izperite vse preostale trdne snovi v umivalnik, nato pa sperite kolono z acetonom v čašo za odpadke. Nadalje očistite kolono z milom in vodo ter jo posušite z ločenimi deli zaporne pipe.
Odpravljanje težav
V koloni se pojavljajo zračni mehurčki
Zračni mehurček je prazen žepek, v katerem ne pride do izravnave med stacionarno in mobilno fazo, zato se komponente po zračnem mehurčku gibljejo hitreje, kot bi se morale. To lahko privede do neenakomernega eluiranja pasov, kar lahko povzroči prekrivanje, če je ločevanje mešanice težavno (če imajo komponente zelo blizu vrednosti Rf, kot na sliki 17).
Če so v koloni vidni zračni mehurčki in pesek ali vzorec še ni bil nanesen, kolono med pakiranjem dobro pretresite, da odstranite vse zračne mehurčke. Če se mehurčki ne premaknejo, se obrnite na inštruktorja, saj ste morda k nalogi pristopili preveč nežno. Če je bil pesek ali vzorec že nanesen, je najbolje pustiti kolono tako, kot je, in upati, da zračni mehurčki ne bodo vplivali na ločevanje.
Pasovi se eluirajo neenakomerno
Če so sestavine zmesi obarvane, je to lahko očitno, če se trakovi eluirajo krivo. To je najverjetneje posledica tega, da je kolona vpeta poševno. Če je kolona vpeta poševno, bodo komponente potovale poševno (slika 18). To lahko povzroči težave pri ločevanju, če imajo komponente podoben Rf.
Te težave ni mogoče rešiti sredi kolone, vendar če imajo komponente zelo različne vrednosti Rf, poševni trakovi morda ne bodo vplivali na ločevanje. V prihodnje obvezno preverite, ali je stolpec popolnoma navpičen tako v smeri od strani proti strani kot od spredaj nazaj.
Last edited by a moderator:
