Введение
Колоночная хроматография является продолжением тонкослойной хроматографии (ТЛХ). Предполагается, что читатель имеет некоторый опыт лабораторной практики и имел дело с тонкослойной хроматографией. Вместо того чтобы наносить образец на тонкий слой кремнезема или глинозема, образец помещают на цилиндр с адсорбентом и непрерывно подают растворитель под давлением до тех пор, пока компоненты полностью не стекут из цилиндра. С помощью этой модификации компоненты можно не только разделять, но и собирать в разные емкости, что позволяет очищать смеси и разделять препараты с загрязнениями. Колоночная хроматография (также известная как "флэш-хроматография") часто используется в научных исследованиях, о чем свидетельствует ее частое присутствие в процедурных разделах журнальных статей.
Процедурное обсуждение
Те же принципы, которые лежат в основе тонкослойной хроматографии (ТСХ), применимы и к колоночной хроматографии. Фактически, перед проведением колоночной хроматографии всегда проводят ТСХ, чтобы оценить ситуацию и определить правильное соотношение растворителей. Для получения хорошего разделения идеально, если нужный компонент имеет Rf около 0,35 (читайте о Rf в теме TLC) и отделен от других компонентов не менее чем 0,2 единицы Rf. Если разделяемые пятна расположены очень близко (разница в Rf < 0,2), лучше всего, если среднее из пятен имеет Rf 0,35. Rf около 0,35 - идеальный вариант, поскольку он достаточно медленный, чтобы произошло уравновешивание стационарной и подвижной фаз, но достаточно быстрый, чтобы свести к минимуму расширение полосы за счет диффузии.
Есть несколько переменных, которые не относятся к TLC, но влияют на разделение компонентов в колоночной хроматографии. К ним относятся диаметр колонки, количество используемого адсорбента и скорость потока растворителя. На рис. 1 показаны рекомендации по выбору колонок в зависимости от размера образца и степени разделения компонентов. Во всех сценариях колонки должны быть подготовлены на высоте 12,5-15 см.
Есть несколько переменных, которые не относятся к TLC, но влияют на разделение компонентов в колоночной хроматографии. К ним относятся диаметр колонки, количество используемого адсорбента и скорость потока растворителя. На рис. 1 показаны рекомендации по выбору колонок в зависимости от размера образца и степени разделения компонентов. Во всех сценариях колонки должны быть подготовлены на высоте 12,5-15 см.
Например, колонка размером 2,5 см должна быть способна очистить около 400 мг материала при хорошем разделении (ΔRf > 0,2, третья колонка на рис. 1) или около 160 мг при сложном разделении (ΔRf > 0,1). Для подготовки и элюирования колонки должно быть использовано около 200 мл растворителя, а для сбора фракций - около 10 мл раствора на каждую.
Существует множество вариантов того, как физически проводить колонки. Одно из существенных различий в методах заключается в способе подготовки колонки. В методе "сухой набивки" сухой кремнезем или глинозем добавляют непосредственно в колонку, и растворитель просачивается через нее порциями, а затем под давлением. При методе "мокрой упаковки" колонку сначала заполняют растворителем, затем слегка встряхивают сухой кремнезем или глинозем, после чего упаковывают под давлением. При методе "суспензии" растворитель добавляют к кремнезему или глинозему в колбе Эрленмейера, выливают на колонку в виде осадка, затем упаковывают под давлением (давление можно создавать с помощью шприца).
Важно знать, что при добавлении растворителя к кремнезему или глинозему выделяется тепло (они обладают экзотермической теплотой сольватации). В этом разделе представлен метод суспензии, основная причина которого заключается в том, что он позволяет проводить эту экзотермическую стадию в колбе Эрленмейера, а не на колонке. Если во время набивки колонки выделяется тепло, это может привести к образованию пузырьков при кипении растворителя. Они могут помешать разделению колонки, если их не удалить должным образом, и могут расколоть адсорбирующий материал в колонке.
Существует множество вариантов того, как физически проводить колонки. Одно из существенных различий в методах заключается в способе подготовки колонки. В методе "сухой набивки" сухой кремнезем или глинозем добавляют непосредственно в колонку, и растворитель просачивается через нее порциями, а затем под давлением. При методе "мокрой упаковки" колонку сначала заполняют растворителем, затем слегка встряхивают сухой кремнезем или глинозем, после чего упаковывают под давлением. При методе "суспензии" растворитель добавляют к кремнезему или глинозему в колбе Эрленмейера, выливают на колонку в виде осадка, затем упаковывают под давлением (давление можно создавать с помощью шприца).
Важно знать, что при добавлении растворителя к кремнезему или глинозему выделяется тепло (они обладают экзотермической теплотой сольватации). В этом разделе представлен метод суспензии, основная причина которого заключается в том, что он позволяет проводить эту экзотермическую стадию в колбе Эрленмейера, а не на колонке. Если во время набивки колонки выделяется тепло, это может привести к образованию пузырьков при кипении растворителя. Они могут помешать разделению колонки, если их не удалить должным образом, и могут расколоть адсорбирующий материал в колонке.
Пошаговые процедуры
a) ТСХ смеси ферроцена и ацетилферроцена, b) Колоночная хроматография
Колонка, изображенная в этом разделе, показывает очистку 0,20 г образца, содержащего смесь ферроцена и ацетилферроцена (неочищенная TLC представлена на рис. 2 a). Фракции объемом около 8 мл были собраны в небольшие пробирки, и было использовано около 400 мл элюента.
a) Пластина TLC смеси ферроцена и ацетилферроцена до элюирования, b) После элюирования, c) Колонка с фриттой, d) Колонка с хлопковым клином на дне, e) Колонка без хлопкового клина (его нужно вставить перед использованием)
Проведите ТСХ
1) Проведите ТСХ с очищаемым образцом (рис. 3 a и b), чтобы определить подходящий растворитель для хроматографии. Желаемый компонент должен иметь Rf около 0,35 и в идеале должен быть отделен от всех остальных пятен не менее чем на 0,2 единицы Rf.
2) Приготовьте партию элюента, дающего соответствующее значение Rf. Количество подготовленного элюента зависит от количества пробы, размера колонки и от того, планируется ли менять состав растворителя в процессе работы. (См. рис. 1 для рекомендаций и элюотропный ряд для определения тенденций в "мощности растворителя").
2) Приготовьте партию элюента, дающего соответствующее значение Rf. Количество подготовленного элюента зависит от количества пробы, размера колонки и от того, планируется ли менять состав растворителя в процессе работы. (См. рис. 1 для рекомендаций и элюотропный ряд для определения тенденций в "мощности растворителя").
Подготовьте насадочную колонку
3) Приобретите подходящую колонку (см. рис. 1) и убедитесь, что рядом с запорным краном есть что-то, что позволит пропускать жидкость, но не твердые частицы. Колонки могут иметь спеченный диск (также известный как "фритта"), рис. 3 в), или пробку из хлопка или стекловаты, оставшуюся от предыдущего пользователя (рис. 3 г). Если диск или пробка отсутствуют (рис. 3 e), вбейте в дно колонки небольшой комок ваты или стекловаты с помощью длинного стержня.
a) Насыпка кремнезема на высоту 12,5-15 см в вытяжном шкафу, b) Насыпание кремнезема в колбу Эрленмейера, c и d) Получение суспензии
Примечание по технике безопасности: порошкообразный диоксид кремния и глинозем являются раздражителями легких, поэтому с ними всегда следует осторожно обращаться в вытяжном шкафу. От просыпанной пыли следует избавляться, протирая ее влажным бумажным полотенцем (во влажном состоянии мелкие частицы менее дисперсны).
5) В вытяжном шкафу пересыпьте отмеренный в колонке адсорбент в колбу Эрленмейера (рис. 4 b), затем добавьте немного элюента (рис. 4 c). Добейтесь рыхлой суспензии, помешивая стеклянной палочкой (рис. 4 d), пока весь адсорбент не будет полностью смочен, пузырьки газа не выйдут, а консистенция не станет несколько густой, но текучей.
a) Заливка суспензии в колонку, b) Промывка колбы, c) Адсорбент прилип к стенкам колонки, d) Промывка от прилипшего адсорбента
6) Поставьте стакан или колбу Эрленмейера под зажатую колонку и откройте запорный кран. Одним быстрым движением взболтайте и влейте суспензию кремнезема или глинозема в колонку с помощью воронки с большим горлом (рис. 5 a). Немедленно используйте больше элюента, чтобы смыть остатки суспензии из колбы Эрленмейера (рис. 5 b) на колонку.
7) Немедленно смойте кремнезем или глинозем со стенок резервуара колонки, используя элюент и вращательные движения пипеткой Пастера (рис. 5 c и d). Если дать адсорбенту высохнуть, он прилипнет к стеклу и не сможет быть легко смыт.
7) Немедленно смойте кремнезем или глинозем со стенок резервуара колонки, используя элюент и вращательные движения пипеткой Пастера (рис. 5 c и d). Если дать адсорбенту высохнуть, он прилипнет к стеклу и не сможет быть легко смыт.
a) Потрясите колонну, чтобы удалить пузырьки воздуха, b) Подайте давление воздуха, c) Добавьте песок, d) Смойте песок с боков
8) Сильно толкните колонку с помощью пробкового кольца или костяшек пальцев (рис. 6 a), чтобы выгнать пузырьки воздуха в колонке (которые могут привести к плохому разделению или растрескиванию адсорбента в колонке) и способствовать равномерному осаждению адсорбента.
9) Осторожно надавите воздухом на верхнюю часть колонки (рис. 6 b), чтобы сжать ее, остановившись, когда уровень элюента будет находиться на расстоянии 1 см от верха колонки. При использовании Т-адаптера с воздушной линией, как на рис. 6 b, точный контроль воздушного потока может быть осуществлен путем регулировки зажима на резиновой трубке. В течение всего процесса элюирования поддерживайте белую колонку адсорбента во влажном состоянии, чтобы уровень элюента был выше верха кремнезема или глинозема. Аккуратно сломайте уплотнение, чтобы прекратить давление, и закройте запорный кран, чтобы жидкость не вытекала дальше.
10) Добавьте тонкий слой песка (рис. 6 c) высотой около 0,5 см. Ополосните стороны колонки элюентом, используя вихревые движения, чтобы согнать песок со стенок стакана (рис. 6 d). Откройте запорный кран и дайте жидкости стечь, пока она не окажется чуть выше слоя песка. Если капание происходит слишком медленно, подайте воздух.
9) Осторожно надавите воздухом на верхнюю часть колонки (рис. 6 b), чтобы сжать ее, остановившись, когда уровень элюента будет находиться на расстоянии 1 см от верха колонки. При использовании Т-адаптера с воздушной линией, как на рис. 6 b, точный контроль воздушного потока может быть осуществлен путем регулировки зажима на резиновой трубке. В течение всего процесса элюирования поддерживайте белую колонку адсорбента во влажном состоянии, чтобы уровень элюента был выше верха кремнезема или глинозема. Аккуратно сломайте уплотнение, чтобы прекратить давление, и закройте запорный кран, чтобы жидкость не вытекала дальше.
10) Добавьте тонкий слой песка (рис. 6 c) высотой около 0,5 см. Ополосните стороны колонки элюентом, используя вихревые движения, чтобы согнать песок со стенок стакана (рис. 6 d). Откройте запорный кран и дайте жидкости стечь, пока она не окажется чуть выше слоя песка. Если капание происходит слишком медленно, подайте воздух.
Добавьте образец
Как только образец помещен в колонку, начинается гонка со временем, поскольку диффузия начнет расширять материал. Образец не следует вносить до тех пор, пока вы не будете готовы немедленно и полностью завершить колонку. Этот процесс может занять от 15 до 90 минут! Если для сбора фракций используются пробирки, то перед добавлением пробы их следует поместить в штатив, а высоту колонки отрегулировать так, чтобы штатив с пробирками мог проскользнуть под ней.
a) Растворение твердого вещества в небольшом количестве дихлорметана, b) Нанесение пробы, c) Промывка пробы в колбе, d) Надавливание для проталкивания пробы на колонку сразу за слоем песка
11) Если сырая проба представляет собой жидкость, используйте ее напрямую (перейдите к шагу 13).
12) Если образец представляет собой твердое вещество, выполните одно из следующих действий.
12) Если образец представляет собой твердое вещество, выполните одно из следующих действий.
a) Идеальная ситуация: растворите твердое вещество в минимальном количестве элюента (не более нескольких мл).
б) Если твердое вещество не особо растворимо или не растворяется в нескольких мл элюента, растворите его в минимальном количестве дихлорметана (не более нескольких мл, рис. 7 а).
в) Если твердое вещество нерастворимо в элюенте, возможна и альтернативная процедура. Растворите твердое вещество в круглодонной колбе в нескольких мл низкокипящего растворителя (например, дихлорметана или ацетона). Добавьте в колбу примерно 1 г кремнезема или глинозема, затем удалите растворитель на роторном испарителе, чтобы осталось твердое вещество, содержащее образец, осажденный на адсорбенте. Наполнив колонку элюентом на дюйм (при использовании этого метода слой песка можно не добавлять), вылейте образец, адсорбированный кремнеземом, на колонку с помощью воронки с широким горлом. Если к стеклу прилипла пыль, промойте его еще элюентом (перейдите к шагу 15).
13) Аккуратно добавьте образец в колонку с помощью пипетки, капая жидкость или раствор прямо на песок кончиком пипетки как можно ближе, а не по бокам (рис. 7 b). Следите за тем, чтобы не вливать жидкость с силой, чтобы в песке или колонке из кремнезема/глинозема не образовались вмятины.
14) Ополосните контейнер с образцом небольшим количеством растворителя (или дихлорметана, если он используется, рис. 7 c) и добавьте промывку в колонку с помощью той же пипетки (чтобы ополоснуть и пипетку).
15) Откройте запорный кран и дайте жидкости вытекать, пока образец не окажется за слоем песка (рис. 7 d) и не попадет в белую область колонки (если это займет более 20 секунд, подайте давление воздуха).
16) Аккуратно промойте боковые стороны колонки, используя 1-2 пипетки, наполненные элюентом, чтобы смыть все брызги образца. Снова дайте жидкости стечь (или надавите воздухом), пока образец не будет вдавлен в белый адсорбент.
Повторяйте промывку до тех пор, пока не убедитесь, что весь образец помещен на адсорбент. Если часть пробы все еще находится в слое песка, она может раствориться в элюенте при добавлении большего количества растворителя, что приведет к потере выхода. Если соединение окрашено, промывка должна быть абсолютно прозрачной.
14) Ополосните контейнер с образцом небольшим количеством растворителя (или дихлорметана, если он используется, рис. 7 c) и добавьте промывку в колонку с помощью той же пипетки (чтобы ополоснуть и пипетку).
15) Откройте запорный кран и дайте жидкости вытекать, пока образец не окажется за слоем песка (рис. 7 d) и не попадет в белую область колонки (если это займет более 20 секунд, подайте давление воздуха).
16) Аккуратно промойте боковые стороны колонки, используя 1-2 пипетки, наполненные элюентом, чтобы смыть все брызги образца. Снова дайте жидкости стечь (или надавите воздухом), пока образец не будет вдавлен в белый адсорбент.
Повторяйте промывку до тех пор, пока не убедитесь, что весь образец помещен на адсорбент. Если часть пробы все еще находится в слое песка, она может раствориться в элюенте при добавлении большего количества растворителя, что приведет к потере выхода. Если соединение окрашено, промывка должна быть абсолютно прозрачной.
a и b) Заполнение резервуара для растворителя, c и d) Элюирование колонки
Заполнение элюентом и элюирование колонки
17) Осторожно добавьте еще элюента с помощью пипетки (рис. 8 a), перемешивая по сторонам, а затем, когда слой песка больше не будет нарушаться при добавлении, осторожно влейте большее количество (рис. 8 b) подготовленного элюента, чтобы заполнить резервуар (или налейте столько, сколько потребуется). Чистый элюент, собранный во время упаковки колонки, может быть использован повторно.
18) С помощью давления воздуха мягко и устойчиво прогоните образец через колонку (рис. 8 c и d). Чем чаще запускать и останавливать давление, тем больше вероятность того, что колонка треснет. Лучше всего, если давление будет поддерживаться мягко и стабильно в течение всего времени.
Оптимальная скорость капельного потока во время элюирования зависит от размера колонки. Идеальным считается поток элюента, когда растворитель в цилиндрической части колонки над адсорбентом падает со скоростью 5 см в минуту. Поэтому скорость каплепадения должна быть меньше в узкой колонке по сравнению с широкой. Скорость каплепадения для однодюймовой колонки должна быть такой, чтобы отдельные капли были едва различимы. Струя жидкости, вытекающая из запорного крана при таком размере колонки, будет слишком быстрой.
18) С помощью давления воздуха мягко и устойчиво прогоните образец через колонку (рис. 8 c и d). Чем чаще запускать и останавливать давление, тем больше вероятность того, что колонка треснет. Лучше всего, если давление будет поддерживаться мягко и стабильно в течение всего времени.
Оптимальная скорость капельного потока во время элюирования зависит от размера колонки. Идеальным считается поток элюента, когда растворитель в цилиндрической части колонки над адсорбентом падает со скоростью 5 см в минуту. Поэтому скорость каплепадения должна быть меньше в узкой колонке по сравнению с широкой. Скорость каплепадения для однодюймовой колонки должна быть такой, чтобы отдельные капли были едва различимы. Струя жидкости, вытекающая из запорного крана при таком размере колонки, будет слишком быстрой.
a-c) Сбор фракций, d) Прогон колонки
Сбор фракций
19) Немедленно начните собирать элюирующую жидкость в пробирки на штативе (рис. 9 а). Рекомендации по объему сбора в каждую пробирку см. на рис. 1.20) Когда первая пробирка заполнится или будет собрана определенная высота жидкости, как рекомендовано преподавателем или на рис. 1, переставьте штатив, чтобы начать сбор в другую пробирку (рис. 9 b и c). Заполняйте и храните пробирки в порядке, установленном на штативе.
Эти разные пробирки называются "фракциями". Цель колонки - собрать достаточно мелкие фракции, чтобы большинство (или некоторые) фракций содержали чистый материал. Если разделение смеси затруднено (если ΔRf компонентов низкая), возможно, лучше собирать мелкие фракции (например, наполовину заполненные пробирки).
Эти разные пробирки называются "фракциями". Цель колонки - собрать достаточно мелкие фракции, чтобы большинство (или некоторые) фракций содержали чистый материал. Если разделение смеси затруднено (если ΔRf компонентов низкая), возможно, лучше собирать мелкие фракции (например, наполовину заполненные пробирки).
a-c) Промывочный материал, попавший на кончик колонки, d) Студенты проводят колонку
21) Когда жидкость стекает с колонки, она часто попадает на внешние стороны наконечника колонки, и когда растворитель испаряется, вы можете увидеть кольцо материала на наконечнике (вы увидите кольцо твердого вещества, если компонент является твердым, как на рис. 10 b, или маслянистые капли, если компонент является жидкостью). Если компоненты окрашены, наконечник колонки следует промыть (рис. 10 в), когда кажется, что один компонент полностью элюировался, и до подхода другого компонента.
22) Периодически следите за уровнем элюента и доливайте его, пока он не опустился ниже слоя песка.
22) Периодически следите за уровнем элюента и доливайте его, пока он не опустился ниже слоя песка.
a) Элюирование, b) Добавление этилацетата для увеличения полярности растворителя, c) Уровень растворителя приближается к слою песка, d) Доливка
Возможно, увеличить полярность растворителя
23) Можно использовать один элюент на всей колонке, особенно если разделяемые компоненты имеют схожие значения Rf. Однако если компоненты имеют очень разные значения Rf, полярность растворителя можно увеличить после элюирования одного компонента из колонки (рис. 11 a).
Увеличение полярности растворителя заставит компоненты двигаться "быстрее". Есть несколько причин, по которым желательно ускорить элюирование. Во-первых, если один компонент уже вышел из колонки, колонка уже выполнила свою работу по разделению, поэтому ускорение процесса не повлияет на чистоту собранных фракций. Во-вторых, чем дольше работает колонка, тем шире будут полосы компонентов (из-за диффузии), а для сбора широкой полосы материала потребуется (и впустую) много растворителя.
Увеличение полярности растворителя заставит компоненты двигаться "быстрее". Есть несколько причин, по которым желательно ускорить элюирование. Во-первых, если один компонент уже вышел из колонки, колонка уже выполнила свою работу по разделению, поэтому ускорение процесса не повлияет на чистоту собранных фракций. Во-вторых, чем дольше работает колонка, тем шире будут полосы компонентов (из-за диффузии), а для сбора широкой полосы материала потребуется (и впустую) много растворителя.
Содержит неполный список элюотропных серий, список распространенных растворителей, ранжированных по их "растворяющей способности" в нормально-фазовой хроматографии. Более полярный растворитель вызывает наиболее резкое увеличение Rf
24) Чтобы увеличить полярность растворителя, его можно капать прямо в элюент на резервуаре колонки (рис. 11 b). Например, если используется смесь гексанов и этилацетата, добавление чистого этилацетата в элюент, находящийся в резервуаре, увеличит его полярность. Если уровень элюента на исходе, можно приготовить раствор, содержащий более высокий процент более полярного компонента. Например, если в колонке сначала использовалась смесь гексанов и этилацетата в соотношении 4:1, то использование смеси 1:1 будет более полярным растворителем.
25) Элюируйте колонку более полярным растворителем, как и раньше, не забывая следить за уровнем элюента и доливать его (рис. 11 d) до того, как он опустится ниже слоя песка.
26) Чтобы увеличить полярность растворителя, полярный растворитель можно капать прямо в элюент на резервуаре колонки (рис. 11 b). Например, если используется смесь гексанов и этилацетата, добавление чистого этилацетата в элюент, находящийся в резервуаре, увеличит его полярность. Если уровень элюента на исходе, можно приготовить раствор, содержащий более высокий процент более полярного компонента. Например, если в колонке сначала использовалась смесь гексанов и этилацетата в соотношении 4:1, то использование смеси 1:1 будет более полярным растворителем.
27) Элюируйте колонку более полярным растворителем, как и раньше, и не забывайте следить за уровнем элюента и доливать его (рис. 11 d) до того, как он опустится ниже слоя песка.
25) Элюируйте колонку более полярным растворителем, как и раньше, не забывая следить за уровнем элюента и доливать его (рис. 11 d) до того, как он опустится ниже слоя песка.
26) Чтобы увеличить полярность растворителя, полярный растворитель можно капать прямо в элюент на резервуаре колонки (рис. 11 b). Например, если используется смесь гексанов и этилацетата, добавление чистого этилацетата в элюент, находящийся в резервуаре, увеличит его полярность. Если уровень элюента на исходе, можно приготовить раствор, содержащий более высокий процент более полярного компонента. Например, если в колонке сначала использовалась смесь гексанов и этилацетата в соотношении 4:1, то использование смеси 1:1 будет более полярным растворителем.
27) Элюируйте колонку более полярным растворителем, как и раньше, и не забывайте следить за уровнем элюента и доливать его (рис. 11 d) до того, как он опустится ниже слоя песка.
a) Исходная пластина TLC, b) Фракции, собранные колонкой, c) Нанесение фракций на пластину TLC, d) Визуализированная пластина TLC с образцами каждой фракции
Найдите и сконцентрируйте нужный компонент
28) Чтобы найти нужный компонент в пробирочных фракциях, полезно понять взаимосвязь между Rf и порядком элюирования в колоночной хроматографии.В колоночной хроматографии образец помещается на колонку и элюируется вниз, в то время как в тонкослойной хроматографии образец наносится на дно пластинки и элюируется вверх. Поэтому колонку можно представить как перевернутую пластину для ТЛК. Соединение с более высокой Rf протекает "быстрее", то есть оно окажется выше на пластине ТЛК и будет собрано первым с помощью колонки. В колонке, изображенной в этом разделе, компонент с более низким Rf (оранжевый на пластинке TLC на рис. 13 a), является компонентом, собранным вторым из колонки.
29) Сначала определите, в каких пробирках содержится растворенное соединение.
29) Сначала определите, в каких пробирках содержится растворенное соединение.
a) Нанесите по образцу каждой фракции на пластинку для ТСХ, помеченную номерами фракций, соответствующими порядку их сбора (рис. 13 c). Возможно, будет лучше нанести каждый образец 2-3 раза друг на друга в случае, если фракции разбавлены.
б) Если было собрано много фракций, и вы не решаетесь взять пробу для каждой фракции, один из методов выявления бесцветных фракций, которые могут содержать соединение, - это поиск намека на осадок в пробирках. После испарения на верхней части пробирки иногда остается твердый осадок (рис. 13) или маслянистые капли, что позволяет предположить, что эти фракции содержат не только растворитель. Возьмите пробы всех фракций рядом с пробирками, содержащими видимый остаток.
c) Визуализируйте пятнистую пластину TLC с помощью УФ-света и/или окрашивания, чтобы определить, какие фракции содержат соединение (рис. 13 d).
a) Пластинки с элюированными TLC фракциями, содержащими возможное соединение, b) Объединение фракций, c) Промывка пробирки с фракциями
28) Проведите ТСХ всех фракций, содержащих соединение, нанося до пяти образцов на пластину шириной 2,5 см. Если есть возможность, для этой цели можно использовать более широкие пластины.
29) Определите соединение с желаемым Rf, сравнив его с исходным сырым образцом на пластине TLC. Выберите для сохранения те фракции, которые содержат желаемое соединение в чистом виде, о чем свидетельствует элюированная пластинка ПЭЖХ. Например, если на рис. 15 a требуется соединение с более высоким Rf, следует оставить фракции 6-10.
30) Объедините чистые фракции в круглодонной колбе подходящего размера (заполненной не более чем наполовину, рис. 15 b). Промойте каждую пробирку небольшим количеством элюента (или другого растворителя, если растворимость является проблемой) и добавьте промывку в круглодонную колбу (рис. 15 c).
31) Выпарите растворитель на роторном испарителе, чтобы оставить очищенное соединение в колбе.
29) Определите соединение с желаемым Rf, сравнив его с исходным сырым образцом на пластине TLC. Выберите для сохранения те фракции, которые содержат желаемое соединение в чистом виде, о чем свидетельствует элюированная пластинка ПЭЖХ. Например, если на рис. 15 a требуется соединение с более высоким Rf, следует оставить фракции 6-10.
30) Объедините чистые фракции в круглодонной колбе подходящего размера (заполненной не более чем наполовину, рис. 15 b). Промойте каждую пробирку небольшим количеством элюента (или другого растворителя, если растворимость является проблемой) и добавьте промывку в круглодонную колбу (рис. 15 c).
31) Выпарите растворитель на роторном испарителе, чтобы оставить очищенное соединение в колбе.
a) Использование давления воздуха для сушки колонки, b) Позволение колонке высохнуть в перевернутом состоянии, c) Сбор отработанного диоксида кремния
Очистка колонки
32) Чтобы высушить колонку, под давлением воздуха слейте большую часть элюента из колонки в контейнер для отходов. Затем дополнительно высушите колонку одним из следующих способов.
a) Оставьте мягкий поток воздуха, проходящий через колонку, чтобы высушить ее, пока вы убираете другие вещи (рис. 16 a).
b) Зажмите колонку вверх дном над большим стаканом для отходов в вытяжном шкафу, чтобы адсорбент упал, когда высохнет (рис. 16 b). Это займет много времени (до следующего урока), но это один из вариантов.
33) Когда адсорбент высохнет, его можно высыпать из колонки в контейнер для отходов в вытяжном шкафу (рис. 16 в).
Примечание по технике безопасности: порошкообразные адсорбенты вызывают раздражение легких, и их опасность усиливается, если в колонке остаются остатки соединений, которые могут попасть в ваши легкие. Насыпать порошки кремнезема или глинозема всегда следует в вытяжном шкафу.
34) Когда большая часть адсорбента будет собрана в контейнер для отходов, смойте водой все остатки твердого вещества в раковину, а затем промойте колонку ацетоном в стакане для отходов. Далее промойте колонку водой с мылом и высушите, разделив части запорного крана.
Примечание по технике безопасности: порошкообразные адсорбенты вызывают раздражение легких, и их опасность усиливается, если в колонке остаются остатки соединений, которые могут попасть в ваши легкие. Насыпать порошки кремнезема или глинозема всегда следует в вытяжном шкафу.
34) Когда большая часть адсорбента будет собрана в контейнер для отходов, смойте водой все остатки твердого вещества в раковину, а затем промойте колонку ацетоном в стакане для отходов. Далее промойте колонку водой с мылом и высушите, разделив части запорного крана.
Устранение неисправностей
В колонке наблюдаются пузырьки воздуха
Воздушный пузырек - это пустой карман, в котором не происходит уравновешивания стационарной и подвижной фаз, поэтому компоненты перемещаются по воздушному пузырьку быстрее, чем должны. Это может привести к неравномерному элюированию полос, что может вызвать перекрытие, если разделение смеси затруднено (если компоненты имеют очень близкие значения Rf, как на рис. 17).
Если в колонке видны пузырьки воздуха, а песок или образец еще не нанесен, хорошенько подтолкните колонку во время укладки, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Если пузырьки не проходят, обратитесь к инструктору, возможно, вы слишком деликатно подходите к задаче. Если песок или образец уже нанесен, лучше оставить колонку как есть и надеяться, что пузырьки воздуха не повлияют на разделение.
Полосы элюируются неравномерно
Если компоненты смеси окрашены, это может быть заметно, когда полосы элюируются неравномерно. Скорее всего, это связано с тем, что колонка зажата под небольшим углом. Если колонка зажата под наклоном, компоненты будут двигаться под наклоном (рис. 18). Это может вызвать проблемы с разделением, если компоненты имеют одинаковый Rf.
Невозможно решить эту проблему на середине колонки, но если компоненты имеют очень разные значения Rf, наклонные полосы могут не повлиять на разделение. В будущем обязательно проверяйте, чтобы колонка была идеально вертикальной как сбоку, так и спереди назад.
Last edited by a moderator:
