Kolomchromatografie

[G.Patton]

Inleiding

Kolomchromatografie is een uitbreiding van dunne laag chromatografie (TLC). Aangenomen wordt dat de lezer enige ervaring heeft met laboratoriumpraktijken en te maken heeft gehad met dunne laag chromatografie. In plaats van een monster op een dunne laag silica of aluminiumoxide aan te brengen, wordt een monster op een cilinder met adsorptiemiddel aangebracht en wordt er continu oplosmiddel onder druk aangebracht totdat de componenten volledig uit de cilinder zijn verdwenen. Met deze modificatie kunnen componenten niet alleen worden gescheiden, maar ook worden verzameld in verschillende containers, waardoor mengsels kunnen worden gezuiverd en geneesmiddelen met verontreinigingen kunnen worden gescheiden. Kolomchromatografie (ook bekend als "flashchromatografie") wordt vaak gebruikt in onderzoeksomgevingen, zoals blijkt uit het feit dat het vaak voorkomt in de procedurele hoofdstukken van tijdschriftartikelen.

Bespreking van de procedure

Dezelfde onderliggende principes van dunne laag chromatografie (TLC) zijn van toepassing op kolomchromatografie. In feite wordt er altijd een TLC uitgevoerd voordat een kolom wordt gebruikt om de situatie te beoordelen en de juiste oplosmiddelverhouding te bepalen. Voor een goede scheiding is het ideaal als de gewenste component een Rf rond 0,35 heeft (lees meer over Rf in het TLC-onderwerp) en van andere componenten wordt gescheiden door ten minste 0,2 Rf-eenheden. Als de te scheiden spots erg dicht bij elkaar liggen (als het verschil in Rf < 0,2 is), is het het beste als het midden van de spots een Rf van 0,35 heeft. Een Rf in de buurt van 0,35 is ideaal omdat dit langzaam genoeg is om stationaire-mobiele fase-equilibratie te laten plaatsvinden, maar snel genoeg om bandverbreding door diffusie te minimaliseren.

Er zijn een paar variabelen die niet van toepassing zijn op TLC, maar die de scheiding van componenten in kolomchromatografie beïnvloeden. Dit zijn onder andere de kolomdiameter, de gebruikte hoeveelheid adsorptiemiddel en de stroomsnelheid van het oplosmiddel. Pic. 1 toont variabele aanbevelingen op basis van de monstergrootte en de scheidingsgraad tussen componenten. In alle scenario's moeten de kolommen worden geprepareerd tussen 12,5-15 cm hoog.

Spoiler: Fig. 1 Overzicht van aanbevolen waarden voor kolomchromatografie

Een kolom van 2,5 cm moet bijvoorbeeld ongeveer 400 mg materiaal kunnen zuiveren als de scheiding goed is (ΔRf > 0,2, derde kolom in afbeelding 1), of ongeveer 160 mg als de scheiding moeilijk is (ΔRf > 0,1). De kolom moet kunnen worden geprepareerd en geëlueerd met ongeveer 200 ml oplosmiddel en de fracties kunnen worden verzameld met ongeveer 10 ml oplossing per stuk.

Er zijn meerdere variaties op de fysieke uitvoering van een kolom. Een groot verschil tussen de methoden is de manier waarop de kolom wordt geprepareerd. Bij de "dry packing" methode wordt droog silica of aluminiumoxide direct aan een kolom toegevoegd en wordt het oplosmiddel er in porties doorheen gesijpeld, vervolgens onder druk. Bij de "natte pakkingmethode" wordt de kolom eerst met oplosmiddel gevuld, dan wordt droog siliciumdioxide of aluminiumoxide er lichtjes doorgeschud en vervolgens onder druk ingepakt. Bij de "slurrymethode" wordt het oplosmiddel in een erlenmeyer aan het silica of aluminiumoxide toegevoegd, als een slurrie op de kolom gegoten en vervolgens onder druk verpakt (de druk kan met een injectiespuit worden geproduceerd).

Het is belangrijk om te weten dat er warmte vrijkomt als er oplosmiddel aan silica of aluminiumoxide wordt toegevoegd (ze hebben een exotherme oploswarmte). De slurrymethode wordt in dit hoofdstuk gepresenteerd, met als belangrijkste reden dat deze exotherme stap in een erlenmeyer kan gebeuren in plaats van op de kolom. Als er warmte vrijkomt tijdens het inpakken van de kolom, kunnen er belletjes ontstaan door het koken van het oplosmiddel. Deze kunnen de scheiding van de kolom verstoren als ze niet goed verwijderd worden en kunnen het adsorptiemateriaal in de kolom doen barsten.

Stap-voor-stap procedures

Spoiler: Fig. 2

a) TLC van ferroceen/acetylferroceenmengsel, b) Kolomchromatografie

De kolom die in dit gedeelte is afgebeeld, toont de zuivering van een monster van 0,20 g dat een mengsel van ferroceen en acetylferroceen bevat (de ruwe TLC staat in Fig.2 a). Er werden ongeveer 8 ml fracties verzameld in kleine reageerbuisjes en er werd ongeveer 400 ml eluent gebruikt.

Spoiler: Fig. 3

a) TLC-plaat van ruw ferroceen/acetylferroceenmengsel vóór elutie, b) Na elutie, c) Kolom met frit, d) Kolom met katoen in de bodem geklemd, e) Kolom zonder de katoenen wig (moet voor gebruik worden ingebracht)

Een TLC uitvoeren

1) Voer een TLC uit op het monster dat moet worden gezuiverd (Fig.3 a en b) om het geschikte oplosmiddel voor chromatografie te bepalen. De gewenste component moet een Rf rond 0,35 hebben en idealiter met minstens 0,2 Rf-eenheden van alle andere spots gescheiden zijn.

2) Bereid een hoeveelheid eluent met de juiste Rf-waarde. De bereide hoeveelheid is afhankelijk van de hoeveelheid monster, de grootte van de kolom en of de oplosmiddelsamenstelling halverwege veranderd moet worden. (Zie Fig. 1 voor richtlijnen en de eluotrope reeks voor trends in "solvent power").

De gepakte kolom voorbereiden

3) Haal een geschikte kolom (zie Fig. 1) en zorg ervoor dat er iets in de buurt van de afsluitkraan is dat vloeistof doorlaat, maar geen vaste stof. Kolommen kunnen een gesinterde schijf hebben (ook bekend als een "frit"), Fig.3 c), of een prop van watten of glaswol die overgebleven is van de vorige gebruiker (Fig.3 d). Als er geen schijf of stop aanwezig is (Fig.3 e), wig dan een klein propje watten of glaswol in de bodem van de kolom met behulp van een lange staaf.

Spoiler: Fig. 4

a) Siliciumdioxide tot 12,5-15 cm hoogte in de zuurkast gieten, b) Siliciumdioxide in een erlenmeyer gieten, c en d) Een slurry maken

4) Zet je kolom perfect verticaal vast op een ringstatief of traliewerk en klem hem op twee plaatsen vast met drievingerklemmen. Giet in de zuurkast silicagel of aluminiumoxide adsorptiemiddel in de kolom tot een hoogte van 12,5-15 cm (Fig.4 a).

Veiligheidsaanwijzing: Silicapoeder en aluminiumoxide zijn irriterend voor de longen en moeten altijd voorzichtig behandeld worden in een zuurkast. Gemorst stof moet verwijderd worden door het met een natte papieren handdoek te dweilen (als het nat is, zijn de fijne deeltjes minder dispergeerbaar).

5) Giet in de zuurkast het in de kolom afgemeten adsorbens in een erlenmeyer (Fig.4 b) en voeg vervolgens wat eluent toe (Fig.4 c). Maak een losse slurry door te zwenken en te roeren met een glazen roerstaaf (Fig.4 d) totdat al het adsorbens volledig nat is, gasbellen vrijkomen en de consistentie enigszins dik, maar gietbaar is.

Spoiler: Fig. 5

a) Giet de slurry in de kolom, b) Spoel de kolf, c) Adsorbens kleeft aan de zijkanten van de kolom, d) Spoel het vastzittende adsorbens af

6) Zet een bekerglas of erlenmeyer onder de vastgeklemde kolom en open de kraan. Zwenk en giet in één snelle beweging de silica- of aluminiumoxideslurry in de kolom met behulp van een trechter met grote opening (fig. 5 a). Gebruik onmiddellijk meer eluent om achtergebleven slurry uit de erlenmeyer (fig. 5 b) en op de kolom te spoelen.

7) Spoel onmiddellijk silica of aluminiumoxide van de zijkanten van het kolomreservoir met behulp van eluent en een draaiende beweging van een pasteurpipet (Fig.5 c en d). Als het adsorptiemiddel opdroogt, blijft het aan het glas kleven en kan het niet gemakkelijk worden afgespoeld.

Spoiler: Fig. 6

a) De kolom schudden om luchtbellen te verwijderen, b) Luchtdruk uitoefenen, c) Zand toevoegen, d) Zand van de zijkanten afspoelen

8) Druk de kolom stevig aan met behulp van een kurkring of je knokkels (Fig.6 a) om eventuele luchtbellen in de kolom te verwijderen (die een slechte scheiding of barsten van het adsorbens in de kolom kunnen veroorzaken), en om een gelijkmatige afzetting van adsorbens te bevorderen.

9) Oefen lichte luchtdruk uit op de bovenkant van de kolom (Fig.6 b) om deze samen te drukken, en stop wanneer het eluentniveau zich 1 cm van de bovenkant van de kolom bevindt. Als een T-adapter wordt gebruikt met de luchtleiding zoals in Fig.6 b, kan de luchtstroom nauwkeurig worden geregeld door de klem op de rubberen slang aan te passen. Houd gedurende het hele elutieproces de witte kolom met adsorptiemiddel nat, met het eluensniveau boven de bovenkant van het silica of aluminiumoxide. Verbreek voorzichtig de afsluiting om de druk te stoppen en sluit de kraan om te voorkomen dat er nog meer vloeistof uitdruppelt.

10) Voeg een dunne laag zand toe (Fig.6 c), ongeveer 0,5 cm hoog. Spoel de zijkanten van de kolom met elutievloeistof met een draaiende beweging om het zand los te maken van de zijkanten van het glas (fig. 6 d). Open de kraan en laat de vloeistof eruit druppelen tot net boven de zandlaag. Oefen luchtdruk uit als het druppelen te langzaam gaat.

Voeg het monster toe

Zodra het monster op de kolom is aangebracht, is er een race tegen de klok, aangezien diffusie het materiaal zal beginnen te verbreden. Een monster mag pas worden aangebracht als je klaar bent om de kolom onmiddellijk en in zijn geheel te voltooien. Dit proces kan 15 tot 90 minuten duren! Als je reageerbuizen gebruikt om fracties te verzamelen, moeten de reageerbuizen in een rekje worden geplaatst voordat je het monster toevoegt en moet de kolomhoogte worden aangepast zodat het reageerbuisrekje eronder kan schuiven.

Spoiler: Fig. 7

a) Los een vaste stof op met een kleine hoeveelheid dichloormethaan, b) Breng het monster aan, c) Spoel het monster in de kolf, d) Oefen druk uit om het monster op de kolom te duwen, net voorbij de zandlaag.

11) Als het ruwe monster vloeibaar is, gebruik het dan direct (ga verder met stap 13).

12) Als het ruwe monster een vaste stof is, doe dan een van de volgende dingen.

a) Ideale situatie: los de vaste stof op in de minimale hoeveelheid van het eluent (hooguit een paar ml).

b ) Als de vaste stof niet bijzonder goed oplosbaar is, of niet oplost in een paar ml van het eluent, los het dan op in de minimale hoeveelheid dichloormethaan (hooguit een paar ml, fig.7 a).

c) Als de vaste stof niet in het eluent oplost, is ook een andere procedure mogelijk. Los de vaste stof op in een rondbodemkolf met een paar ml van een oplosmiddel met een laag kookpunt (bijv. dichloormethaan of aceton). Voeg aan de erlenmeyer ongeveer 1 g silica of aluminiumoxide toe en verwijder het oplosmiddel met de rotatieverdamper zodat er een vaste stof overblijft die het monster bevat dat op het adsorbens is afgezet. Giet het met silica geadsorbeerde monster op de kolom met behulp van een trechter met brede opening, terwijl er een inch eluent op de gepakte kolom rust (sla de zandlaag over als deze methode wordt gebruikt). Als er stof aan het glas blijft kleven, spoel het dan af met meer eluent (ga verder met stap 15).

13) Voeg voorzichtig het monster toe aan de kolom met behulp van een pipet, waarbij de vloeistof of oplossing direct op het zand wordt gedruppeld met de pipetpunt zo dicht als je kunt, niet langs de zijkanten (Fig.7 b). Zorg ervoor dat je de vloeistof er niet met kracht in spuit, zodat er inkepingen in het zand of de silicium/aluminakolom ontstaan.

14) Spoel de monsterpot met een beetje oplosmiddel (of dichloormethaan indien gebruikt, Fig.7 c) en voeg het spoelwater toe aan de kolom met dezelfde pipet (om de pipet ook te spoelen).

15) Open de kraan en laat de vloeistof eruit druppelen totdat het monster net voorbij de zandlaag is (Fig.7 d) en in het witte gedeelte van de kolom terechtkomt (pas luchtdruk toe als dit meer dan 20 seconden duurt).

16) Spoel voorzichtig de zijkanten van de kolom met een draaiende beweging met 1-2 pipetten vol eluent om eventueel gespat monster weg te spoelen. Laat opnieuw vloeistof uitdruppelen (of oefen luchtdruk uit) totdat het monster in het witte adsorptiemiddel is geduwd.

Herhaal de spoelstap totdat u er zeker van bent dat het volledige monster op het adsorptiemiddel is gedeponeerd. Als er zich nog wat monster in de zandlaag bevindt, kan het oplossen in het eluent wanneer er meer oplosmiddel wordt toegevoegd, wat leidt tot opbrengstverlies. Als de verbinding gekleurd is, moet de spoeling volledig helder zijn.

Spoiler: Fig. 8

a en b) Vullen van het oplosmiddelreservoir, c en d) Elueren van de kolom

Dekolom vullen en elueren

17) Voeg voorzichtig meer eluent toe met behulp van een pipet (Fig.8 a), zwenk langs de zijkanten en giet voorzichtig grotere hoeveelheden (Fig.8 b) van het bereide eluent om het reservoir te vullen (of vul met zoveel als nodig is) wanneer de zandlaag niet meer verstoord wordt door de toevoegingen. Schoon eluent dat is verzameld tijdens het inpakken van de kolom kan opnieuw worden gebruikt.

18) Gebruik luchtdruk om het monster voorzichtig en gelijkmatig door de kolom te elueren (Fig.8 c en d). Hoe vaker de druk wordt gestart en gestopt, hoe groter de kans dat de kolom barst. Het is het beste als de druk de hele tijd zacht en constant kan worden gehouden.

De optimale druppelsnelheid tijdens elutie hangt af van de grootte van de kolom. De ideale stroom van elutievloeistof is wanneer het oplosmiddel in het cilindrische gedeelte van de kolom boven het adsorptiemiddel met 5 cm per minuut daalt. Daarom moet de druppelsnelheid bij een smalle kolom lager zijn dan bij een bredere kolom. De druppelsnelheid voor een kolom van één inch moet zo zijn dat de afzonderlijke druppels nauwelijks te onderscheiden zijn. Een vloeistofstroom die uit de kraan stroomt met een kolom van deze grootte is iets te snel.

Spoiler: Fig. 9

a-c) Fracties verzamelen, d) Kolom laten lopen

Fracties verzamelen

19) Begin onmiddellijk met het verzamelen van de elutievloeistof in reageerbuizen op een rek (Fig.9 a). Zie Fig.1 voor aanbevelingen over de volumes die in elke reageerbuis moeten worden verzameld.

20) Wanneer de eerste reageerbuis gevuld is, of wanneer een bepaalde hoeveelheid vloeistof verzameld is zoals aanbevolen door je instructeur of Fig.1, verplaats dan het rekje om te beginnen met het verzamelen in een andere buis (Fig.9 b en c). Vul de buisjes en houd ze op volgorde op het rek.

Deze verschillende buisjes worden "fracties" genoemd. Het doel van een kolom is om kleine fracties te verzamelen die zo klein zijn dat de meeste (of sommige) fracties zuiver materiaal bevatten. Als de scheiding van het mengsel moeilijk is (als de ΔRf van de componenten laag is), kan het het beste zijn om kleine fracties te verzamelen (bijvoorbeeld halfgevulde buisjes).

Spoiler: Fig. 10

a-c) Spoelmateriaal dat op het uiteinde van de kolom is gespat, d) Studenten laten een kolom draaien

21) Als vloeistof van de kolom afloopt, spat het vaak op de buitenkant van het uiteinde van de kolom en als het oplosmiddel verdampt, kun je een ring van materiaal op het uiteinde zien (je ziet een ring van vaste stof als het bestanddeel een vaste stof is zoals in Fig. 10 b, of olieachtige druppels als het bestanddeel een vloeistof is). Als de componenten gekleurd zijn, moet de kolomtip worden gespoeld (Fig.10 c) wanneer het lijkt alsof een component volledig geëlueerd is en voordat de andere component nadert.

22) Houd het eluentniveau regelmatig in de gaten en vul bij voordat het onder de zandlaag zakt.

Spoiler: Fig. 11

a) Elutie, b) Toevoeging van ethylacetaat om de polariteit van het oplosmiddel te verhogen, c) Niveau van het oplosmiddel nadert de zandlaag, d) Bijvullen

Mogelijk de polariteit van het oplosmiddel verhogen

23) Er kan één eluent over de hele kolom worden gebruikt, vooral als de te scheiden componenten vergelijkbare Rf-waarden hebben. Als de componenten echter zeer verschillende Rf-waarden hebben, kan de polariteit van het oplosmiddel worden verhoogd nadat één component uit de kolom is geëlueerd (Fig.11 a).

Door de polariteit van het oplosmiddel te verhogen, gaan de componenten "sneller" elueren. Er zijn verschillende redenen waarom een snellere elutie gewenst is. Ten eerste, als een component de kolom al heeft verlaten, heeft de kolom zijn scheidingswerk al gedaan, dus het proces versnellen heeft geen invloed op de zuiverheid van de verzamelde fracties. Ten tweede, hoe langer het duurt om een kolom te laten draaien, hoe breder de componentbanden zullen zijn (als gevolg van diffusie), en het verzamelen van een brede band van materiaal zal veel oplosmiddel gebruiken (en verspillen).

Spoiler: Fig. 12

Bevat een gedeeltelijke lijst van de eluotrope reeksen, een lijst van veelgebruikte oplosmiddelen gerangschikt naar hun "oploskracht" in normale-fasechromatografie. Het meer polaire oplosmiddel veroorzaakt de meest dramatische toename in Rf

24) Om de polariteit van het oplosmiddel te verhogen, kan het polaire oplosmiddel direct in het eluent op het kolomreservoir worden gedruppeld (Fig.11 b). Als bijvoorbeeld een hexaan:ethylacetaatmengsel wordt gebruikt, kan de polariteit worden verhoogd door zuiver ethylacetaat toe te voegen aan het eluent dat zich momenteel in het reservoir bevindt. Als het eluentniveau laag wordt, kan een oplossing worden bereid die een hoger percentage van de polaire component bevat. Als de kolom bijvoorbeeld eerst een 4:1 mengsel van hexaan en ethylacetaat gebruikte, zou het gebruik van een 1:1 mengsel een polairder oplosmiddel zijn.

25) Elueer de kolom met het meer polaire oplosmiddel zoals eerder, en denk er altijd aan om het eluentniveau in de gaten te houden en bij te vullen (Fig.11 d) voordat het onder de zandlaag zakt.

26) Om de polariteit van het oplosmiddel te verhogen, kan het polaire oplosmiddel direct in het elutievloeistof op het kolomreservoir worden gedruppeld (Fig.11 b). Als bijvoorbeeld een hexaan:ethylacetaatmengsel wordt gebruikt, kan de polariteit worden verhoogd door zuiver ethylacetaat toe te voegen aan het eluent dat zich momenteel in het reservoir bevindt. Als het eluentniveau laag wordt, kan een oplossing worden bereid die een hoger percentage van de polaire component bevat. Als de kolom bijvoorbeeld eerst een 4:1 mengsel van hexaan en ethylacetaat gebruikte, zou het gebruik van een 1:1 mengsel een polairder oplosmiddel zijn.

27) Elueer de kolom met het meer polaire oplosmiddel zoals eerder, en denk er altijd aan om het eluentniveau in de gaten te houden en bij te vullen (Fig.11 d) voordat het onder de zandlaag zakt.

Spoiler: Fig. 13

a) Originele TLC-plaat, b) Fracties verzameld door de kolom, c) Fracties op een TLC-plaat spuiten, d) Een gevisualiseerde TLC-plaat met monsters van elke fractie.

Het gewenste bestanddeel vinden en concentreren

28) Bij het vinden van het gewenste bestanddeel in de reageerbuisfracties is het nuttig om de relatie tussen Rf en elutievolgorde bij kolomchromatografie te begrijpen.

Bij kolomchromatografie wordt het monster op de kolom afgezet en naar beneden geëlueerd, terwijl bij dunnelaagchromatografie het monster op de bodem van de plaat wordt afgezet en naar boven wordt geëlueerd. Daarom kan een kolom worden gezien als een omgekeerde TLC-plaat. Een verbinding met een hogere Rf loopt "sneller", wat betekent dat deze hoger op een TLC-plaatje terechtkomt en met een kolom als eerste wordt opgevangen. In de kolom die in dit hoofdstuk is afgebeeld, is de component met de lagere Rf (oranje op de TLC-plaat in Fig.13 a) de component die als tweede van de kolom wordt opgehaald.

29) Bepaal eerst welke reageerbuizen opgeloste verbindingen bevatten.

a ) Plaats een monster van elke fractie op een TLC-plaatje met daarop de nummers van de fracties in de volgorde waarin ze zijn verzameld (fig. 13 c). Het kan het beste zijn om elk monster 2-3 keer over elkaar heen te spuiten voor het geval de fracties verdund zijn.

b) Als er veel fracties verzameld zijn, waardoor je aarzelt om elke fractie te bemonsteren, is een methode om kleurloze fracties te identificeren die mogelijk een verbinding bevatten, te zoeken naar een vleugje residu dat de reageerbuizen leidt. Na verdamping blijft er soms een vast residu (Fig.13) of olieachtige druppels achter op de bovenkant van de reageerbuis, waardoor duidelijk wordt dat die fracties meer dan alleen oplosmiddel bevatten. Neem een monster van alle fracties in de buurt van de buisjes met zichtbaar residu.

Spoiler: Fig.14 Ring van vaste stof gezien op buisranden na verdamping

c) Visualiseer de gevlekte TLC-plaat met UV-licht en/of een kleurstof om te bepalen welke fracties de verbinding bevatten (Fig.13 d)

Spoiler: Fig. 15

a) geëlueerde TLC-platen van fracties die een mogelijke verbinding bevatten, b) combineren van fracties, c) spoelen van een fractiebuisje

28) Voer een TLC uit van alle fracties die een verbinding bevatten, waarbij maximaal vijf monsters per 2,5 cm breed TLC-plaatje worden gespot. Voor dit doel kunnen bredere TLC-plaatjes worden gebruikt als die beschikbaar zijn.

29) Identificeer de verbinding met de gewenste Rf door vergelijking met het oorspronkelijke ruwe TLC-plaatje. Kies de fracties met de gewenste verbinding in zuivere vorm, zoals blijkt uit het geëlueerde TLC-plaatje. Als bijvoorbeeld de verbinding met de hogere Rf gewenst is in Fig.15 a, moeten fracties 6-10 worden bewaard.

30) Voeg de zuivere fracties samen in een rondbodemkolf van geschikte grootte (niet meer dan halfvol, fig. 15 b). Spoel elke reageerbuis met een kleine hoeveelheid eluent (of een ander oplosmiddel als oplosbaarheid een probleem is) en voeg het spoelwater toe aan de rondbodemkolf (fig. 15 c).

31) Damp het oplosmiddel in met de rotatieverdamper zodat de gezuiverde verbinding in de erlenmeyer achterblijft.

Spoiler: Fig. 16

a) Gebruik luchtdruk om de kolom te drogen, b) Laat de kolom ondersteboven drogen, c) Verzamel het silica-afval

De kolom schoonmaken

32) Om de kolom te drogen, past u luchtdruk toe om het grootste deel van de eluent uit de kolom in een afvalcontainer af te voeren. Droog de kolom vervolgens verder op een van deze manieren.

a) Laat een zachte luchtstroom door de kolom lopen om deze verder te drogen terwijl je andere dingen opruimt (Fig.16 a).

b ) Klem de kolom ondersteboven boven een groot afvalbekerglas in de zuurkast, zodat het adsorptiemiddel valt als het gedroogd is (Fig.16 b). Dit duurt lang (tot de volgende les), maar is een optie.

33) Als het adsorbens droog is, kan het uit de kolom worden gegoten in een afvalcontainer in de zuurkast (Fig.16 c).

Veiligheidsaanwijzing: Poedervormige adsorptiemiddelen irriteren de longen en het gevaar wordt nog groter als de kolom reststoffen bevat die nu in de longen terecht kunnen komen. Het gieten van silica- of aluminiumoxidepoeders moet altijd in de zuurkast gebeuren.

34) Als het grootste deel van het adsorptiemiddel is opgevangen in een afvalbak, spoel dan met water de overgebleven vaste stof af in de gootsteen en spoel vervolgens de kolom met aceton af in een afvalbeker. Reinig de kolom verder met water en zeep en droog hem met de onderdelen van de kraan los van elkaar.

Problemen oplossen

Er zijn luchtbellen te zien in de kolom

Een luchtbel is een lege zak waar de stationaire-mobiele fase-evenwichtigheid niet plaatsvindt, dus componenten bewegen sneller rond een luchtbel dan zou moeten. Dit kan leiden tot ongelijkmatige eluerende banden, wat overlap kan veroorzaken als de scheiding van het mengsel moeilijk is (als de componenten zeer nauwe Rf-waarden hebben, zoals in Fig.17).

Spoiler: Fig. 17 Effect van een luchtbel op de scheiding in een kolom

Als er luchtbellen in de kolom te zien zijn en het zand of monster is nog niet aangebracht, schud de kolom dan goed tijdens het inpakken om alle luchtbellen te verwijderen. Neem contact op met je instructeur als de luchtbellen niet weggaan, omdat je de taak misschien te voorzichtig aanpakt. Als het zand of monster al is aangebracht, kun je de kolom het beste zo laten en hopen dat de luchtbellen de scheiding niet beïnvloeden.

De banden elueren ongelijkmatig

Als de componenten van een mengsel gekleurd zijn, kan het duidelijk zijn als de banden scheef elueren. Dit komt waarschijnlijk doordat de kolom enigszins diagonaal is geklemd. Als de kolom schuin wordt vastgeklemd, zullen de componenten op een schuine manier elueren (Fig. 18). Dit kan scheidingsproblemen veroorzaken als de componenten een vergelijkbare Rf hebben.

Spoiler: Fig. 18 Effect van een scheve kolom op scheiding

Er is geen manier om dit probleem halverwege een kolom op te lossen, maar als de componenten erg verschillende Rf-waarden hebben, hebben de schuine banden mogelijk geen effect op de scheiding. Controleer in de toekomst of de kolom perfect verticaal staat in zowel de zijwaartse als de voor-achterverwaartse richting.

 

[davlovsky]

Dus terwijl we het monster elueren, bepaalt de polariteit van het eluent welke moleculen in het monster je absorbeert in het eluent en vervolgens verzamelt in je reeks reageerbuizen. Maar de cutoff lijkt een beetje "onnauwkeurig", d.w.z. het RF-verschil tussen de ene reageerbuis en de volgende kan relatief klein zijn, en als je de RF-waarde die hoort bij de combinatie monster-eluent nog niet kent, hoe weet je dan welke reageerbuizen wat bevatten?

In de video's die ik zag, begonnen ze met in principe pure monsters, waarop ze hun TLC uitvoerden om hun RF-waarden te verkrijgen, zodat ze, terwijl ze hun kolomchromatografie uitvoerden, meer TLC konden doen op elke reageerbuis om erachter te komen welke reageerbuis wat bevatte, maar nogmaals, als je geen referentie hebt voor de RF-waarde, hoe zou je dan te werk gaan?

Staan deze RF-waarden in de literatuur? Bij LSD-synthese geven ze je bijvoorbeeld de samenstelling van het eluent (een mengsel van 3:1 C6H6/CHCl3), maar geen RF-waarde voor die combinatie van LSD en eluent. Is het zo dat ze al weten (door trial and error of meer geavanceerde berekeningen) dat het 3:1 C6H6/CHCl3 mengsel zal resulteren in een RF-waarde van 0,35 voor een monster van LSD freebase?

 

[Sue]

Voor lysergiden gebruiken ze meestal een UV (black light) om de banden en druppels die uit de kolom komen te zien/volgen...