Įvadas
Koloninė chromatografija yra plonasluoksnės chromatografijos (TLC) tęsinys. Daroma prielaida, kad skaitytojas turi tam tikros laboratorinės praktikos patirties ir yra susidūręs su plonasluoksne chromatografija. Vietoj to, kad mėginys būtų dedamas ant plono silicio dioksido arba aliuminio oksido sluoksnio, mėginys dedamas ant adsorbento cilindro, o tirpiklis nuolat spaudžiamas, kol komponentai visiškai išteka iš cilindro. Naudojant šią modifikaciją komponentus galima ne tik atskirti, bet ir surinkti į skirtingas talpyklas, todėl galima išgryninti mišinius ir atskirti vaistus su teršalais. Koloninė chromatografija (dar vadinama "blykstine chromatografija"), dažnai naudojama mokslinių tyrimų aplinkoje, tai liudija jos dažnas pasitaikymas žurnalų straipsnių procedūriniuose skyriuose.
Procedūrų aptarimas
Stulpelinei chromatografijai taikomi tie patys pagrindiniai plonasluoksnės chromatografijos (TLC) principai. Iš tikrųjų prieš atliekant kolonėlinę chromatografiją visada atliekama TLC, kad būtų įvertinta situacija ir nustatytas tinkamas tirpiklio santykis. Norint gauti gerą atskyrimą, idealu, jei norimo komponento Rf yra apie 0,35 (apie Rf skaitykite TLC temoje) ir jį nuo kitų komponentų skiria bent 0,2 Rf vieneto. Jei atskiriamos dėmės yra labai arti (jei Rf skirtumas < 0,2), geriausia, jei dėmės vidurio Rf yra 0,35. Rf, artimas 0,35, yra idealus, nes jis yra pakankamai lėtas, kad įvyktų stacionariosios ir mobiliosios fazių pusiausvyra, bet pakankamai greitas, kad juostos išsiplėtimas dėl difuzijos būtų minimalus.
Yra keletas kintamųjų, kurie netaikomi TLC, bet turi įtakos komponentų atskyrimui kolonėlinėje chromatografijoje. Tai kolonėlės skersmuo, naudojamo adsorbento kiekis ir tirpiklio srauto greitis. Paveikslas. 1 parodytos kintamųjų rekomendacijos, pagrįstos mėginio dydžiu ir komponentų atskyrimo laipsniu. Pagal visus scenarijus kolonėlės turi būti paruošiamos 12,5-15 cm aukštyje.
Yra keletas kintamųjų, kurie netaikomi TLC, bet turi įtakos komponentų atskyrimui kolonėlinėje chromatografijoje. Tai kolonėlės skersmuo, naudojamo adsorbento kiekis ir tirpiklio srauto greitis. Paveikslas. 1 parodytos kintamųjų rekomendacijos, pagrįstos mėginio dydžiu ir komponentų atskyrimo laipsniu. Pagal visus scenarijus kolonėlės turi būti paruošiamos 12,5-15 cm aukštyje.
Pavyzdžiui, 2,5 cm ilgio kolonėle turėtų būti galima išgryninti apie 400 mg medžiagos, jei atskyrimas yra geras (ΔRf > 0,2, 1 pav. trečioji kolonėlė), arba apie 160 mg, jei atskyrimas yra sudėtingas (ΔRf > 0,1). Kolonėlę turėtų būti galima paruošti ir išskalauti naudojant maždaug 200 ml tirpiklio, o frakcijas surinkti naudojant maždaug po 10 ml tirpalo.
Yra daugybė fizinio kolonėlės paleidimo variantų. Vienas didelis metodų skirtumas yra tai, kaip paruošiama kolonėlė. Taikant "sausos pakuotės" metodą, sausas silicio dioksidas arba aliuminio oksidas dedamas tiesiai į kolonėlę, o tirpiklis leidžiamas praleisti dalimis, paskui spaudžiant. Taikant "šlapios pakuotės" metodą, kolona pirmiausia pripildoma tirpiklio, tada sausas silicio dioksidas arba aliuminio oksidas lengvai suplakamas, tada pakuojama spaudžiant. Taikant "tirštojo tirpiklio" metodą, tirpiklis įpilamas į Erlenmejerio kolboje esantį silicio dioksidą arba aliuminio oksidą, supilamas į kolonėlę kaip dumblas, po to pakuojamas slėgiu (slėgis gali būti sukuriamas švirkštu).
Svarbu žinoti, kad tirpiklį pridėjus prie silicio dioksido arba aliuminio oksido išsiskiria šiluma (jų tirpimo šiluma yra egzoterminė). Šiame skyriuje pateikiamas suspensijos metodas, kurio pagrindinė priežastis yra ta, kad šis egzoterminis etapas vyksta Erlenmejerio kolboje, o ne kolonėlėje. Jei šiluma išsiskiria pakuojant koloną, gali susidaryti burbuliukų dėl tirpiklio virimo. Jie gali trukdyti kolonėlės atskyrimui, jei nėra tinkamai pašalinami, ir gali įtrūkti adsorbcinė medžiaga kolonėlėje.
Yra daugybė fizinio kolonėlės paleidimo variantų. Vienas didelis metodų skirtumas yra tai, kaip paruošiama kolonėlė. Taikant "sausos pakuotės" metodą, sausas silicio dioksidas arba aliuminio oksidas dedamas tiesiai į kolonėlę, o tirpiklis leidžiamas praleisti dalimis, paskui spaudžiant. Taikant "šlapios pakuotės" metodą, kolona pirmiausia pripildoma tirpiklio, tada sausas silicio dioksidas arba aliuminio oksidas lengvai suplakamas, tada pakuojama spaudžiant. Taikant "tirštojo tirpiklio" metodą, tirpiklis įpilamas į Erlenmejerio kolboje esantį silicio dioksidą arba aliuminio oksidą, supilamas į kolonėlę kaip dumblas, po to pakuojamas slėgiu (slėgis gali būti sukuriamas švirkštu).
Svarbu žinoti, kad tirpiklį pridėjus prie silicio dioksido arba aliuminio oksido išsiskiria šiluma (jų tirpimo šiluma yra egzoterminė). Šiame skyriuje pateikiamas suspensijos metodas, kurio pagrindinė priežastis yra ta, kad šis egzoterminis etapas vyksta Erlenmejerio kolboje, o ne kolonėlėje. Jei šiluma išsiskiria pakuojant koloną, gali susidaryti burbuliukų dėl tirpiklio virimo. Jie gali trukdyti kolonėlės atskyrimui, jei nėra tinkamai pašalinami, ir gali įtrūkti adsorbcinė medžiaga kolonėlėje.
Žingsnis po žingsnio procedūros
a) feroceno ir acetilferoceno mišinio TLC, b ) koloninė chromatografija
Šiame skyriuje pavaizduota kolonėlė rodo 0,20 g mėginio, kuriame yra ferroceno ir acetilferroceno mišinio, gryninimą (neapdorotas TLC pavaizduotas 2 pav. a). Maždaug 8 ml frakcijos buvo surinktos į nedidelius mėgintuvėlius, sunaudota maždaug 400 ml eliuento.
a) Neapdoroto feroceno ir acetilferoceno mišinio TLC plokštelė prieš eluciją, b ) po elucijos, c ) kolonėlė su fritomis, d ) kolonėlė su medvilniniu pleištu dugne, e) kolonėlė be medvilninio pleišto (prieš naudojant reikės įdėti medvilninį pleištą)
Atlikite TLC
1) Atlikite gryninamo mėginio TLC (3 a ir b pav.), kad nustatytumėte, koks tirpiklis tinkamas chromatografijai. Norimo komponento Rf turėtų būti apie 0,35 ir idealiu atveju jis turėtų būti atskirtas nuo visų kitų dėmių bent 0,2 Rf vieneto.
2 ) Paruoškite tokią eliuento partiją, kuri suteikia tinkamą Rf vertę. Paruoštas kiekis priklauso nuo mėginio kiekio, kolonėlės dydžio ir nuo to, ar viduryje planuojama keisti tirpiklio sudėtį. (Žr. 1 pav. rekomendacijas ir eluotropinių serijų "tirpiklio galios" tendencijas).
2 ) Paruoškite tokią eliuento partiją, kuri suteikia tinkamą Rf vertę. Paruoštas kiekis priklauso nuo mėginio kiekio, kolonėlės dydžio ir nuo to, ar viduryje planuojama keisti tirpiklio sudėtį. (Žr. 1 pav. rekomendacijas ir eluotropinių serijų "tirpiklio galios" tendencijas).
Supakuotos kolonėlės paruošimas
3) Įsigykite tinkamą kolonėlę (žr. 1 pav.) ir įsitikinkite, kad šalia uždaromojo čiaupo yra kas nors, kas praleistų skystį, bet ne kietą kūną. Kolonėlės gali turėti sukepintą diską (dar vadinamą "frita"), 3 c pav.), arba nuo ankstesnio naudotojo likusį medvilnės ar stiklo vatos kamštį (3 d pav.). Jei disko ar kamščio nėra (3 pav., e), į kolonos dugną ilgu strypu įkiškite nedidelę vatos ar stiklo vatos gumulėlį.
a ) Silicio dioksido pylimas iki 12,5-15 cm aukščio garų gaubte, b) Silicio dioksido pylimas į Erlenmejerio kolbą, c ir d) Tirščių gamyba
Saugos pastaba: Silicio dioksido ir aliuminio oksido milteliai dirgina plaučius, todėl su jais visada reikia atsargiai dirbti garų gaubte. Išsiliejusias dulkes reikia pašalinti šluostant drėgnu popieriniu rankšluosčiu (jei jis drėgnas, smulkios dalelės mažiau išsisklaido).
5 ) Dūmų gaubte į Erlenmejerio kolbą supilkite kolonėlėje išmatuotą adsorbentą (4 b pav.), tada įpilkite šiek tiek eliuento (4 c pav.). Padarykite purią suspensiją sukdami ir maišydami stikline maišykle (4 d pav.), kol visas adsorbentas visiškai sudrėks, išsiskirs dujų burbuliukai, o konsistencija bus šiek tiek tiršta, bet puri.
a) suspensijos supylimas į koloną, b) kolbos išskalavimas, c ) prie kolonos šonų prilipęs adsorbentas, d) prilipusio adsorbento nuplovimas
6 ) Po užspausta kolonėle pastatykite ąsotį arba Erlenmejerio kolbą ir atidarykite kamštį. Vienu greitu judesiu suvirpinkite ir dideliu piltuvėliu su didele anga įpilkite silicio dioksido arba aliuminio oksido suspensiją į koloną (5 pav., a). Nedelsiant naudokite daugiau eliuento, kad iš Erlenmejerio kolbos (5 pav., b) išplautumėte srutų likučius ant kolonos.
7) Nedelsiant nuplaukite visą silicio dioksidą ar aliuminio oksidą nuo kolonėlės rezervuaro šonų naudodami eliuentą ir sukamaisiais judesiais Pasteuro pipete (5 c ir d pav.). Jei leisite išdžiūti, adsorbentas prilips prie stiklo ir jo nebus lengva nuplauti.
7) Nedelsiant nuplaukite visą silicio dioksidą ar aliuminio oksidą nuo kolonėlės rezervuaro šonų naudodami eliuentą ir sukamaisiais judesiais Pasteuro pipete (5 c ir d pav.). Jei leisite išdžiūti, adsorbentas prilips prie stiklo ir jo nebus lengva nuplauti.
a ) Kolonėlės stumdymas, kad būtų pašalinti oro burbuliukai, b) Oro slėgio taikymas, c ) Smėlio pridėjimas, d) Smėlio nuplovimas nuo šonų
8) Stipriai stumdykite kolonėlę naudodami kamštinį žiedą arba kumščius (6 pav., a), kad išstumtumėte oro burbuliukus kolonėlėje (dėl kurių gali blogai atsiskirti arba skilti adsorbentas kolonėlėje) ir paskatintumėte tolygų adsorbento nusėdimą.
9) Švelniu oro slėgiu suspauskite kolonėlės viršų (6 pav., b), kad ją suspaustumėte, ir sustabdykite, kai eliuento lygis bus 1 cm nuo kolonėlės viršaus. Jei su oro linija naudojamas T formos adapteris, kaip parodyta 6 pav. b, oro srautą galima tiksliai reguliuoti reguliuojant guminio vamzdelio suspaudimo spaustuką. Per visą eliucijos procesą baltą adsorbento stulpelį laikykite drėgną, o eliuento lygis turi būti aukščiau silicio dioksido arba aliuminio oksido viršaus. Švelniai nutraukite sandariklį, kad nustotų veikti slėgis, ir uždarykite kamštį, kad skystis nebetekėtų toliau.
10) Įpilkite ploną, maždaug 0,5 cm aukščio smėlio sluoksnį (6 pav., c). Kolonėlės šonus nuplaukite eliuentu sukamaisiais judesiais, kad smėlis atsiplautų nuo stiklo šonų (6 d pav.). Atidarykite kamštį ir leiskite skysčiui lašėti, kol jis bus šiek tiek aukščiau smėlio sluoksnio. Jei lašėjimas vyksta per lėtai, panaudokite oro slėgį.
9) Švelniu oro slėgiu suspauskite kolonėlės viršų (6 pav., b), kad ją suspaustumėte, ir sustabdykite, kai eliuento lygis bus 1 cm nuo kolonėlės viršaus. Jei su oro linija naudojamas T formos adapteris, kaip parodyta 6 pav. b, oro srautą galima tiksliai reguliuoti reguliuojant guminio vamzdelio suspaudimo spaustuką. Per visą eliucijos procesą baltą adsorbento stulpelį laikykite drėgną, o eliuento lygis turi būti aukščiau silicio dioksido arba aliuminio oksido viršaus. Švelniai nutraukite sandariklį, kad nustotų veikti slėgis, ir uždarykite kamštį, kad skystis nebetekėtų toliau.
10) Įpilkite ploną, maždaug 0,5 cm aukščio smėlio sluoksnį (6 pav., c). Kolonėlės šonus nuplaukite eliuentu sukamaisiais judesiais, kad smėlis atsiplautų nuo stiklo šonų (6 d pav.). Atidarykite kamštį ir leiskite skysčiui lašėti, kol jis bus šiek tiek aukščiau smėlio sluoksnio. Jei lašėjimas vyksta per lėtai, panaudokite oro slėgį.
Įpilkite mėginį
Kai mėginys patenka į kolonėlę, prasideda lenktynės su laiku, nes dėl difuzijos medžiaga pradės plėstis. Mėginys neturėtų būti dedamas tol, kol nesate pasiruošę iš karto užbaigti visą kolonėlę. Šis procesas gali užtrukti nuo 15 iki 90 minučių! Jei frakcijoms rinkti naudojami mėgintuvėliai, prieš įdedant mėginį, mėgintuvėliai turėtų būti sudėti į stovą, o kolonėlės aukštis turėtų būti sureguliuotas taip, kad mėgintuvėlių stovas galėtų slysti apačioje.
a ) Kietosios medžiagos tirpinimas nedideliu kiekiu dichlormetano, b ) mėginio užpylimas, c ) mėginio plovimas kolbelėje, d) mėginio stūmimas slėgiu į kolonėlę iškart už smėlio sluoksnio
11) Jei neapdorotas mėginys yra skystis, naudokite jį tiesiogiai (pereikite prie 13 veiksmo).
12 ) Jei neapdorotas mėginys yra kietas, atlikite vieną iš toliau nurodytų veiksmų.
12 ) Jei neapdorotas mėginys yra kietas, atlikite vieną iš toliau nurodytų veiksmų.
a) Ideali situacija: ištirpinkite kietąją medžiagą mažiausiame eliuento kiekyje (ne daugiau kaip keli ml).
b ) Jei kietoji medžiaga nėra ypač tirpi arba neištirpsta keliuose ml eliuento, ištirpinkite ją mažiausiame dichlormetano kiekyje (ne daugiau kaip keli ml, 7 pav., a).
c ) Jei kietoji medžiaga netirpsta eliuente, galima taikyti ir kitą procedūrą. Kietąją medžiagą ištirpinkite kolboje su apvaliu dugnu, naudodami kelis ml mažai verdančio tirpiklio (pvz., dichlormetano arba acetono). Į kolbą įpilkite maždaug 1 g silicio dioksido arba aliuminio oksido, tada tirpiklį pašalinkite sukamuoju garintuvu, kad liktų kietoji medžiaga, kurioje yra ant adsorbento nusėdęs mėginys. Kai ant užpildytos kolonos yra colis eliuento (jei taikomas šis metodas, smėlio sluoksnis nepridedamas), silicio dioksido adsorbuotą mėginį ant kolonos supilkite plačiakakčiu piltuvėliu. Jei ant stiklo prilipo dulkių, nuplaukite jį didesniu kiekiu eliuento (pereikite prie 15 veiksmo).
13) Švelniai pipete įpilkite mėginį į kolonėlę, lašindami skystį ar tirpalą tiesiai ant smėlio pipetės antgaliu kuo arčiau, o ne į šonus (7 b pav.). Stebėkite, kad skysčio nepurkštumėte per jėgą, kad smėlyje ar silicio dioksido / aliuminio oksido kolonėlėje neliktų įdubimų.
14) Išplaukite mėginio talpyklą trupučiu tirpiklio (arba dichlormetano, jei naudojamas, 7 c pav.) ir įpilkite į kolonėlę, naudodami tą pačią pipetę (kad išplautumėte ir pipetę).
15) Atidarykite uždaromąjį čiaupą ir leiskite skysčiui lašėti tol, kol mėginys atsidurs vos už smėlio sluoksnio (7 d pav.) ir pateks į baltąją kolonėlės sritį (jei tai užtrunka ilgiau nei 20 sekundžių, panaudokite oro slėgį).
16) Sukamaisiais judesiais švelniai nuplaukite kolonėlės šonus, naudodami 1-2 pilnas pipetes praskiesto tirpalo, kad nuplautumėte bet kokį išpurkštą mėginį. Vėlgi leiskite skysčiui lašėti (arba naudokite oro slėgį), kol mėginys bus įstumtas į baltą adsorbentą.
Skalavimo veiksmą kartokite tol, kol įsitikinsite, kad visas mėginys nusėdo ant adsorbento. Jei dalis mėginio vis dar yra smėlio sluoksnyje, įpylus daugiau tirpiklio, jis gali ištirpti eliuente, todėl išeiga gali sumažėti. Jei junginys yra spalvotas, skalaujant turėtų būti visiškai skaidrus.
14) Išplaukite mėginio talpyklą trupučiu tirpiklio (arba dichlormetano, jei naudojamas, 7 c pav.) ir įpilkite į kolonėlę, naudodami tą pačią pipetę (kad išplautumėte ir pipetę).
15) Atidarykite uždaromąjį čiaupą ir leiskite skysčiui lašėti tol, kol mėginys atsidurs vos už smėlio sluoksnio (7 d pav.) ir pateks į baltąją kolonėlės sritį (jei tai užtrunka ilgiau nei 20 sekundžių, panaudokite oro slėgį).
16) Sukamaisiais judesiais švelniai nuplaukite kolonėlės šonus, naudodami 1-2 pilnas pipetes praskiesto tirpalo, kad nuplautumėte bet kokį išpurkštą mėginį. Vėlgi leiskite skysčiui lašėti (arba naudokite oro slėgį), kol mėginys bus įstumtas į baltą adsorbentą.
Skalavimo veiksmą kartokite tol, kol įsitikinsite, kad visas mėginys nusėdo ant adsorbento. Jei dalis mėginio vis dar yra smėlio sluoksnyje, įpylus daugiau tirpiklio, jis gali ištirpti eliuente, todėl išeiga gali sumažėti. Jei junginys yra spalvotas, skalaujant turėtų būti visiškai skaidrus.
a ir b) tirpiklio rezervuaro užpildymas, c ir d) kolonėlės išplovimas
Užpildykite tirpikliu ir išskalaukite kolonėlę
17) Pipete (8 pav., a) atsargiai įpilkite daugiau eliuento (8 pav., a), sukdami į šonus, o tada, kai smėlio sluoksnis nebebūtų pažeidžiamas įpilant, atsargiai įpilkite didesnį kiekį (8 pav., b) paruošto eliuento, kad užpildytumėte rezervuarą (arba užpildykite tiek, kiek gali prireikti). Švarų eliuentą, surinktą pakuojant koloną, galima naudoti pakartotinai.
18) Oro slėgiu švelniai ir tolygiai eluhuokite mėginį per kolonėlę (8 c ir d pav.). Kuo daugiau kartų slėgis bus paleidžiamas ir stabdomas, tuo didesnė tikimybė, kad kolonėlė gali įtrūkti. Geriausia, jei slėgį visą laiką galima palaikyti švelnų ir tolygų.
Optimalus lašėjimo greitis elucijos metu priklauso nuo kolonėlės dydžio. Idealus eliuento srautas yra tada, kai tirpiklis cilindrinėje kolonėlės dalyje virš adsorbento laša 5 cm per minutę. Todėl lašėjimo greitis siauroje kolonėlėje turėtų būti lėtesnis, palyginti su platesne kolonėle. Vieno colio kolonėlės lašėjimo greitis turėtų būti toks, kad atskirus lašelius būtų galima vos atskirti. Tokio dydžio kolonėlėje iš užsukimo čiaupo liejamo skysčio srovė yra šiek tiek per greita.
18) Oro slėgiu švelniai ir tolygiai eluhuokite mėginį per kolonėlę (8 c ir d pav.). Kuo daugiau kartų slėgis bus paleidžiamas ir stabdomas, tuo didesnė tikimybė, kad kolonėlė gali įtrūkti. Geriausia, jei slėgį visą laiką galima palaikyti švelnų ir tolygų.
Optimalus lašėjimo greitis elucijos metu priklauso nuo kolonėlės dydžio. Idealus eliuento srautas yra tada, kai tirpiklis cilindrinėje kolonėlės dalyje virš adsorbento laša 5 cm per minutę. Todėl lašėjimo greitis siauroje kolonėlėje turėtų būti lėtesnis, palyginti su platesne kolonėle. Vieno colio kolonėlės lašėjimo greitis turėtų būti toks, kad atskirus lašelius būtų galima vos atskirti. Tokio dydžio kolonėlėje iš užsukimo čiaupo liejamo skysčio srovė yra šiek tiek per greita.
a-c) Frakcijų rinkimas, d) Kolonėlės paleidimas
Frakcijų rinkimas
19) Iš karto pradėkite rinkti išsiskiriantį skystį į mėgintuvėlius ant stovo (9 pav., a). Žr. 1 pav. rekomendacijas dėl tūrio, kurį reikia surinkti į kiekvieną mėgintuvėlį.20) Kai prisipildo pirmasis mėgintuvėlis arba kai surenkamas tam tikro aukščio skystis, kaip rekomenduoja instruktorius arba 1 pav., perstumkite stovą ir pradėkite rinkti į kitą mėgintuvėlį (9 pav., b ir c). Pripildykite ir laikykite mėgintuvėlius ant stovo tvarkingai.
Šie skirtingi mėgintuvėliai vadinami "frakcijomis". Kolonėlės tikslas - surinkti pakankamai mažas frakcijas, kad daugumoje (arba kai kuriose) frakcijų būtų grynos medžiagos. Jei mišinį atskirti sunku (jei komponentų ΔRf yra mažas), geriausia rinkti mažas frakcijas (pvz., pusiau užpildytus mėgintuvėlius).
Šie skirtingi mėgintuvėliai vadinami "frakcijomis". Kolonėlės tikslas - surinkti pakankamai mažas frakcijas, kad daugumoje (arba kai kuriose) frakcijų būtų grynos medžiagos. Jei mišinį atskirti sunku (jei komponentų ΔRf yra mažas), geriausia rinkti mažas frakcijas (pvz., pusiau užpildytus mėgintuvėlius).
a-c) Skalavimo medžiaga, paplauta ant kolonėlės galo, d) Studentai, paleidžiantys kolonėlę.
21) Kai skystis nuteka iš kolonėlės, jis dažnai purškiamas ant kolonėlės antgalio išorinės pusės, o tirpikliui išgaravus, ant ant antgalio gali atsirasti medžiagos žiedas (jei komponentas yra kietas, kaip parodyta 10 b pav. paveikslėlyje, matysite kietos medžiagos žiedą, jei komponentas yra kietas, arba riebius lašelius, jei komponentas yra skystas). Jei komponentai yra spalvoti, kolonos antgalį reikia nuplauti (10 c pav.), kai atrodo, kad vienas komponentas visiškai išsiskyrė, ir prieš artėjant kitam komponentui.
22) Periodiškai stebėkite eliuento lygį ir papildykite, kol jis nenukrito žemiau smėlio sluoksnio.
22) Periodiškai stebėkite eliuento lygį ir papildykite, kol jis nenukrito žemiau smėlio sluoksnio.
a) Išplovimas, b ) etilacetato pridėjimas tirpiklio poliškumui padidinti, c ) tirpiklio lygis artėja prie smėlio sluoksnio, d) papildymas
Galimas tirpiklio poliškumo padidinimas
23) Visoje kolonėlėje gali būti naudojamas vienas eliuentas, ypač jei skirstomų komponentų Rf vertės panašios. Tačiau jei komponentų Rf vertės labai skiriasi, tirpiklio poliškumas gali būti padidintas po to, kai vienas iš komponentų išsiplauna iš kolonėlės (11 pav., a).
Padidinus tirpiklio poliškumą, komponentai keliauja "greičiau". Yra keletas priežasčių, dėl kurių norima greitesnio išsiskyrimo. Pirma, jei vienas komponentas jau išėjo iš kolonėlės, kolonėlė jau atliko savo darbą, todėl proceso pagreitinimas neturės įtakos surinktų frakcijų grynumui. Antra, kuo ilgiau trunka kolonėlės veikimas, tuo platesnės bus komponentų juostos (dėl difuzijos), o renkant plačią medžiagos juostą bus sunaudojama (ir išeikvojama) daug tirpiklio.
Padidinus tirpiklio poliškumą, komponentai keliauja "greičiau". Yra keletas priežasčių, dėl kurių norima greitesnio išsiskyrimo. Pirma, jei vienas komponentas jau išėjo iš kolonėlės, kolonėlė jau atliko savo darbą, todėl proceso pagreitinimas neturės įtakos surinktų frakcijų grynumui. Antra, kuo ilgiau trunka kolonėlės veikimas, tuo platesnės bus komponentų juostos (dėl difuzijos), o renkant plačią medžiagos juostą bus sunaudojama (ir išeikvojama) daug tirpiklio.
Pateikiamas dalinis eluotropinių serijų sąrašas - įprastų tirpiklių, išrikiuotų pagal jų "tirpiklio galią" normaliosios fazės chromatografijoje, sąrašas. Labiau poliarinis tirpiklis labiausiai padidina Rf
24) Norint padidinti tirpiklio poliškumą, polinį tirpiklį galima lašinti tiesiai į eliuentą kolonėlės rezervuare (11 pav., b). Pavyzdžiui, jei naudojamas heksanų ir etilacetato mišinys, į šiuo metu rezervuare esantį eliuentą įpylus gryno etilacetato, padidėtų jo poliškumas. Jei eliuento lygis yra žemas, galima paruošti tirpalą, kuriame yra didesnis poliškesnio komponento procentas. Pavyzdžiui, jei kolonėlėje iš pradžių buvo naudojamas 4:1 heksanų ir etilacetato mišinys, naudojant 1:1 mišinį, tirpiklis būtų labiau poliarinis.
25 ) Kolonėlę eluktuokite labiau poliariniu tirpikliu, kaip ir anksčiau, ir visada nepamirškite stebėti eliuento lygio ir papildykite (11 d pav.), kol jis nenukrito žemiau smėlio sluoksnio.
26) Norint padidinti tirpiklio poliškumą, polinį tirpiklį galima lašinti tiesiai į eliuentą kolonėlės rezervuare (11 b pav.). Pavyzdžiui, jei naudojamas heksanų ir etilacetato mišinys, į šiuo metu rezervuare esantį eliuentą įpylus gryno etilacetato, padidėtų jo poliškumas. Jei eliuento lygis yra žemas, galima paruošti tirpalą, kuriame yra didesnis poliškesnio komponento procentas. Pavyzdžiui, jei kolonėlėje iš pradžių buvo naudojamas 4:1 heksanų ir etilacetato mišinys, naudojant 1:1 mišinį, tirpiklis būtų labiau poliarinis.
27) Eliuuktuokite kolonėlę labiau poliariniu tirpikliu kaip ir anksčiau, ir visada nepamirškite stebėti eliuento lygį bei papildyti (11 d pav.), kol jis nenukrito žemiau smėlio sluoksnio.
25 ) Kolonėlę eluktuokite labiau poliariniu tirpikliu, kaip ir anksčiau, ir visada nepamirškite stebėti eliuento lygio ir papildykite (11 d pav.), kol jis nenukrito žemiau smėlio sluoksnio.
26) Norint padidinti tirpiklio poliškumą, polinį tirpiklį galima lašinti tiesiai į eliuentą kolonėlės rezervuare (11 b pav.). Pavyzdžiui, jei naudojamas heksanų ir etilacetato mišinys, į šiuo metu rezervuare esantį eliuentą įpylus gryno etilacetato, padidėtų jo poliškumas. Jei eliuento lygis yra žemas, galima paruošti tirpalą, kuriame yra didesnis poliškesnio komponento procentas. Pavyzdžiui, jei kolonėlėje iš pradžių buvo naudojamas 4:1 heksanų ir etilacetato mišinys, naudojant 1:1 mišinį, tirpiklis būtų labiau poliarinis.
27) Eliuuktuokite kolonėlę labiau poliariniu tirpikliu kaip ir anksčiau, ir visada nepamirškite stebėti eliuento lygį bei papildyti (11 d pav.), kol jis nenukrito žemiau smėlio sluoksnio.
a) Pirminė TLC plokštelė, b ) Kolonėle surinktos frakcijos, c) Frakcijų dėmių užrašymas ant TLC plokštelės, d) Vizualizuota kiekvienos frakcijos mėginių TLC plokštelė.
Ieškoti ir koncentruoti norimą komponentą
28) Ieškant norimo komponento mėgintuvėlio frakcijose, naudinga suprasti ryšį tarp Rf ir elucijos tvarkos kolonėlinėje chromatografijoje.Kolonėlinės chromatografijos metu mėginys nusėda ant kolonėlės viršaus ir elucionuojamas žemyn, o plonasluoksnės chromatografijos metu mėginys nusėda ant plokštelės dugno ir elucionuojamas aukštyn. Todėl kolonėlę galima laikyti apversta TLC plokštele. Junginys, kurio Rf yra didesnis, "bėga greičiau", t. y. TLC plokštelėje jis atsidurs aukščiau, o kolonėlėje bus surinktas pirmas. Šiame skyriuje pavaizduotoje kolonėlėje komponentas su mažesniu Rf (oranžinės spalvos TLC plokštelėje 13 a pav.) yra komponentas, kuris iš kolonėlės surenkamas antras.
29) Pirmiausia nustatykite, kuriuose mėgintuvėliuose yra ištirpusio junginio.
29) Pirmiausia nustatykite, kuriuose mėgintuvėliuose yra ištirpusio junginio.
a) Ant TLC plokštelės, paženklintos frakcijų numeriais, atitinkančiais jų surinkimo eiliškumą (13 pav., c), užfiksuokite kiekvienos frakcijos mėginį. Gali būti geriausia kiekvieną mėginį dėti 2-3 kartus vieną ant kito, jei frakcijos yra praskiestos.
b) Jei surinkta daug frakcijų, todėl nesiryžtate imti kiekvienos frakcijos mėginių, vienas iš būdų nustatyti bespalves frakcijas, kuriose gali būti junginio, yra ieškoti likučių, vedančių į mėgintuvėlius. Išgaravus, kartais mėgintuvėlio viršuje lieka kietos liekanos (13 pav.) arba riebūs lašeliai, todėl akivaizdu, kad tose frakcijose yra ne tik tirpiklio. Paimkite mėginius iš visų frakcijų, esančių šalia mėgintuvėlių, kuriuose yra matomų likučių.
c) Vizualizuokite dėmėtą TLC plokštelę naudodami UV šviesą ir (arba) dažiklį, kad nustatytumėte, kuriose frakcijose yra junginio (13 d pav.)
a ) Frakcijų, kuriose yra galimo junginio, išsiskyrusios TLC plokštelės, b ) Frakcijų sujungimas, c ) Frakcijų mėgintuvėlio skalavimas
28) Atlikite visų frakcijų, kuriose yra junginio, TLC, į 2,5 cm pločio TLC plokštelę įterpdami iki penkių mėginių. Šiam tikslui galima naudoti platesnes TLC plokšteles, jei jų yra.
29) Palyginę su pradine neapdorotos frakcijos TLC plokštele, nustatykite junginį, turintį reikiamą Rf. Pasirinkite pasilikti frakcijas, kuriose pageidaujamas junginys yra grynos formos, kaip matyti iš elucionuotos TLC plokštelės. Pavyzdžiui, jei 15 a pav. pageidaujamas junginys su didesniu Rf, reikėtų pasilikti 6-10 frakcijas.
30) Grynąsias frakcijas sumaišykite į tinkamo dydžio kolbą su apvaliu dugnu (ne daugiau kaip iki pusės užpildytą, 15 b pav.). Kiekvieną mėgintuvėlį praskalaukite nedideliu kiekiu tirpiklio (arba kito tirpiklio, jei tirpumas yra problema) ir supilkite į kolbą su apvaliu dugnu (15 c pav.).
31) Išgarinkite tirpiklį sukamuoju garintuvu, kad kolboje liktų išgrynintas junginys.
29) Palyginę su pradine neapdorotos frakcijos TLC plokštele, nustatykite junginį, turintį reikiamą Rf. Pasirinkite pasilikti frakcijas, kuriose pageidaujamas junginys yra grynos formos, kaip matyti iš elucionuotos TLC plokštelės. Pavyzdžiui, jei 15 a pav. pageidaujamas junginys su didesniu Rf, reikėtų pasilikti 6-10 frakcijas.
30) Grynąsias frakcijas sumaišykite į tinkamo dydžio kolbą su apvaliu dugnu (ne daugiau kaip iki pusės užpildytą, 15 b pav.). Kiekvieną mėgintuvėlį praskalaukite nedideliu kiekiu tirpiklio (arba kito tirpiklio, jei tirpumas yra problema) ir supilkite į kolbą su apvaliu dugnu (15 c pav.).
31) Išgarinkite tirpiklį sukamuoju garintuvu, kad kolboje liktų išgrynintas junginys.
a ) Naudojant oro slėgį kolonėlei išdžiovinti, b ) Leidžiant kolonėlei išdžiūti aukštyn kojomis, c) Surenkant silicio dioksido atliekas
Kolonos valymas
32) Norėdami išdžiovinti kolonėlę, oro slėgiu iš kolonėlės į atliekų talpyklą išleiskite didžiąją dalį eliuento. Tada toliau džiovinkite kolonėlę vienu iš šių metodų.
a) palikite prijungtą švelnią oro srovę, tekančią per kolonėlę, kad toliau ją džiovintumėte, kol valote kitus daiktus (16 pav., a).
b ) Užspauskite kolonėlę aukštyn kojomis virš didelės atliekų taurės garų gaubte, kad išdžiūvęs adsorbentas nukristų (16 pav., b). Tai užtruks ilgai (iki kitos klasės pamokos), tačiau yra viena iš galimybių.
33) Išdžiūvusį adsorbentą galima išpilti iš kolonos į atliekų talpyklą, esančią garų gaubte (16 c pav.).
Saugos pastaba: adsorbentų milteliai dirgina plaučius, o jų keliamas pavojus dar labiau padidėja, jei kolonėlėje yra likučių, kurie dabar gali patekti į plaučius. Silicio dioksido arba aliuminio oksido miltelius visada reikia pilti garų gaubte.
34) Kai didžioji dalis adsorbento bus surinkta į atliekų talpyklą, vandeniu nuplaukite visus kietųjų medžiagų likučius į kriauklę, o tada koloną išplaukite acetonu į atliekų ąsotį. Toliau nuvalykite kolonėlę vandeniu su muilu ir išdžiovinkite atskirtais kamščiais.
Saugos pastaba: adsorbentų milteliai dirgina plaučius, o jų keliamas pavojus dar labiau padidėja, jei kolonėlėje yra likučių, kurie dabar gali patekti į plaučius. Silicio dioksido arba aliuminio oksido miltelius visada reikia pilti garų gaubte.
34) Kai didžioji dalis adsorbento bus surinkta į atliekų talpyklą, vandeniu nuplaukite visus kietųjų medžiagų likučius į kriauklę, o tada koloną išplaukite acetonu į atliekų ąsotį. Toliau nuvalykite kolonėlę vandeniu su muilu ir išdžiovinkite atskirtais kamščiais.
Gedimų šalinimas
Kolonėlėje matomi oro burbuliukai
Oro burbuliukas - tai tuščia kišenė, kurioje nevyksta stacionariosios ir mobiliosios fazių pusiausvyra, todėl komponentai oro burbuliuke juda greičiau, nei turėtų. Dėl to gali susidaryti nevienodos elucijos juostos, kurios gali persidengti, jei mišinį sunku atskirti (jei komponentų Rf vertės labai artimos, kaip 17 pav.).
Jei kolonėlėje pastebimi oro burbuliukai, o smėlis arba mėginys dar nepateiktas, pakuodami kolonėlę gerai ją papurtykite, kad pašalintumėte visus oro burbuliukus. Jei burbuliukai nepajuda, kreipkitės į instruktorių, nes gali būti, kad į užduotį žiūrite per švelniai. Jei smėlis arba mėginys jau užneštas, geriausia koloną palikti tokią, kokia ji yra, ir tikėtis, kad oro burbuliukai neturės įtakos atskyrimui.
Grupės išsiskiria netolygiai
Jei mišinio komponentai yra spalvoti, tai gali būti akivaizdu, kai juostos eluliuojasi kreivai. Taip greičiausiai atsitinka dėl to, kad kolonėlė užspausta šiek tiek įstrižai. Jei kolonėlė užspausta įstrižai, komponentai keliaus įstrižai (18 pav.). Dėl to gali kilti atskyrimo problemų, jei komponentai turi panašų Rf.
Nėra būdo, kaip išspręsti šią problemą kolonos viduryje, tačiau jei komponentų Rf vertės labai skiriasi, pasvirusios juostos gali neturėti įtakos atskyrimui. Ateityje būtinai patikrinkite, ar kolona yra visiškai vertikali tiek šono-šono, tiek priekio-atakos kryptimis.
Last edited by a moderator:
