Johdanto
Pylväskromatografia on ohutkerroskromatografian (TLC) jatke. Oletetaan, että lukijalla on jonkin verran kokemusta laboratorioharjoittelusta ja että hän on käsitellyt ohutkerroskromatografiaa. Sen sijaan, että näyte levitettäisiin ohuelle piidioksidi- tai alumiinioksidikerrokselle, näyte asetetaan adsorbenttisylinteriin, ja liuotinta levitetään jatkuvasti paineen alaisena, kunnes komponentit valuvat kokonaan sylinteristä. Tällä muutoksella komponentteja voidaan paitsi erottaa myös kerätä eri astioihin, jolloin voidaan puhdistaa seoksia ja erottaa toisistaan lääkkeet, joissa on epäpuhtauksia. Pylväskromatografiaa (tunnetaan myös nimellä "flash-kromatografia") käytetään usein tutkimusympäristöissä, mistä on osoituksena sen yleinen esiintyminen lehtiartikkelien menettelytapaosioissa.
Menetelmäkeskustelu
Kolonnikromatografiaan sovelletaan samoja periaatteita kuin ohutkerroskromatografiaan (TLC). Itse asiassa TLC tehdään aina ennen kolonnin suorittamista tilanteen arvioimiseksi ja oikean liuotinsuhteen määrittämiseksi. Hyvän erotuksen saamiseksi on ihanteellista, jos halutun komponentin Rf on noin 0,35 (lue Rf:stä TLC-aiheesta) ja se erotetaan muista komponenteista vähintään 0,2 Rf-yksikköä. Jos erotettavat läiskät ovat hyvin lähellä toisiaan (jos Rf-ero on < 0,2), on parasta, jos läiskien keskellä on Rf 0,35. Rf lähellä 0,35 on ihanteellinen, koska se on riittävän hidas, jotta stationaarisen ja liikkuvan faasin tasapainottuminen voi tapahtua, mutta riittävän nopea, jotta diffuusiosta johtuva kaistan leveneminen on mahdollisimman vähäistä.
On olemassa muutamia muuttujia, joita ei voida soveltaa TLC:hen, mutta jotka vaikuttavat komponenttien erottamiseen pylväskromatografiassa. Näitä ovat kolonnin halkaisija, käytetyn adsorbentin määrä ja liuottimen virtausnopeus. Kuva. 1 esitetään muuttujasuositukset näytteen koon ja komponenttien erotteluasteen perusteella. Kaikissa skenaarioissa kolonnit on esivalmisteltava 12,5-15 cm:n korkeuteen.
On olemassa muutamia muuttujia, joita ei voida soveltaa TLC:hen, mutta jotka vaikuttavat komponenttien erottamiseen pylväskromatografiassa. Näitä ovat kolonnin halkaisija, käytetyn adsorbentin määrä ja liuottimen virtausnopeus. Kuva. 1 esitetään muuttujasuositukset näytteen koon ja komponenttien erotteluasteen perusteella. Kaikissa skenaarioissa kolonnit on esivalmisteltava 12,5-15 cm:n korkeuteen.
.
Esimerkiksi 2,5 cm:n kolonnilla pitäisi pystyä puhdistamaan noin 400 mg materiaalia, jos erottuminen on hyvä (ΔRf > 0,2, kuvan 1 kolmas kolonni), tai noin 160 mg, jos erottuminen on vaikeaa (ΔRf > 0,1). Kolonni on voitava valmistaa ja eluoida käyttämällä noin 200 ml liuotinta, ja fraktiot voidaan kerätä noin 10 ml:lla liuosta kutakin.
Kolonnin fyysisestä ajamisesta on useita eri vaihtoehtoja. Yksi suuri ero menetelmissä on se, miten kolonni valmistetaan. Kuivapakkausmenetelmässä kuiva piidioksidi tai alumiinioksidi lisätään suoraan kolonniin, ja liuottimen annetaan valua kolonnin läpi annoksittain ja sitten paineen alaisena. Märkäpakkausmenetelmässä kolonni täytetään ensin liuottimella, sitten kuivaa piidioksidia tai alumiinioksidia ravistellaan kevyesti ja sitten pakataan paineella. Lietemenetelmässä liuotin lisätään piidioksidiin tai alumiinioksidiin Erlenmeyer-kolvissa, kaadetaan kolonniin lietteenä ja pakataan sitten paineen alaisena (paine voidaan tuottaa ruiskulla).
On tärkeää tietää, että lämpöä vapautuu, kun liuotinta lisätään piidioksidiin tai alumiinioksidiin (niillä on eksoterminen liukenemislämpö). Tässä jaksossa esitellään lietemenetelmä, jonka pääasiallinen syy on se, että sen avulla tämä eksoterminen vaihe voidaan suorittaa Erlenmeyer-kolvissa kolonnin sijasta. Jos lämpöä vapautuu kolonnin pakkaamisen aikana, se voi synnyttää kuplia liuottimen kiehumisesta. Nämä voivat häiritä kolonnin erottelua, jos niitä ei poisteta riittävästi, ja ne voivat halkaista kolonnin adsorbenttimateriaalin.
Kolonnin fyysisestä ajamisesta on useita eri vaihtoehtoja. Yksi suuri ero menetelmissä on se, miten kolonni valmistetaan. Kuivapakkausmenetelmässä kuiva piidioksidi tai alumiinioksidi lisätään suoraan kolonniin, ja liuottimen annetaan valua kolonnin läpi annoksittain ja sitten paineen alaisena. Märkäpakkausmenetelmässä kolonni täytetään ensin liuottimella, sitten kuivaa piidioksidia tai alumiinioksidia ravistellaan kevyesti ja sitten pakataan paineella. Lietemenetelmässä liuotin lisätään piidioksidiin tai alumiinioksidiin Erlenmeyer-kolvissa, kaadetaan kolonniin lietteenä ja pakataan sitten paineen alaisena (paine voidaan tuottaa ruiskulla).
On tärkeää tietää, että lämpöä vapautuu, kun liuotinta lisätään piidioksidiin tai alumiinioksidiin (niillä on eksoterminen liukenemislämpö). Tässä jaksossa esitellään lietemenetelmä, jonka pääasiallinen syy on se, että sen avulla tämä eksoterminen vaihe voidaan suorittaa Erlenmeyer-kolvissa kolonnin sijasta. Jos lämpöä vapautuu kolonnin pakkaamisen aikana, se voi synnyttää kuplia liuottimen kiehumisesta. Nämä voivat häiritä kolonnin erottelua, jos niitä ei poisteta riittävästi, ja ne voivat halkaista kolonnin adsorbenttimateriaalin.
Vaiheittaiset menettelyt
a) Ferroseenin ja asetyyliferroseenin seoksen TLC, b) Pylväskromatografia.
Tässä jaksossa kuvattu kolonni osoittaa 0,20 g:n näytteen puhdistusta, joka sisältää ferroseenin ja asetyyliferroseenin seosta (raa'an TLC on kuvassa 2 a). Noin 8 ml:n fraktiot kerättiin pieniin koeputkiin, ja eluenttia käytettiin noin 400 ml.
a) TLC-levy raa'asta ferroseeni/asetyyliferroseeniseoksesta ennen eluointia, b) eluoinnin jälkeen, c) kolonni fritillä, d) kolonni, jonka pohjaan on kiilattu puuvillaa, e) kolonni, josta puuttuu puuvillakiila (se on asetettava ennen käyttöä).
Suoritetaan TLC
1) Tee TLC puhdistettavalle näytteelle (kuva 3 a ja b) sopivan kromatografialiuottimen määrittämiseksi. Halutun komponentin Rf-arvon pitäisi olla noin 0,35, ja sen pitäisi mieluiten erota kaikista muista pisteistä vähintään 0,2 Rf-yksikköä.
2) Valmistetaan eluentti erä, joka antaa oikean Rf-arvon. Valmistettava määrä riippuu näytemäärästä, kolonnin koosta ja siitä, aiotaanko liuottimen koostumusta muuttaa kesken prosessin. (Katso ohjeet kuvasta 1 ja "liuottimen tehon" kehityssuuntaukset eluotrosarjasta).
2) Valmistetaan eluentti erä, joka antaa oikean Rf-arvon. Valmistettava määrä riippuu näytemäärästä, kolonnin koosta ja siitä, aiotaanko liuottimen koostumusta muuttaa kesken prosessin. (Katso ohjeet kuvasta 1 ja "liuottimen tehon" kehityssuuntaukset eluotrosarjasta).
Pakatun kolonnin valmistelu
3) Hanki sopiva kolonni (ks. kuva 1) ja varmista, että venttiilin lähellä on jotain, joka päästää nesteen läpi, mutta ei kiinteää ainetta. Kolonnissa voi olla sintrattu levy (tunnetaan myös nimellä "fritti"), kuva 3 c), tai edelliseltä käyttäjältä jäänyt puuvilla- tai lasivillatulppa (kuva 3 d). Jos kiekkoa tai tulppaa ei ole (kuva 3 e), kiilaa pieni vanu- tai lasivillatäyte kolonnin pohjaan pitkällä sauvalla.
a) Piidioksidin kaataminen 12,5-15 cm:n korkeudelle huurteenpoistossa, b) Piidioksidin kaataminen Erlenmeyer-kolviin, c ja d) lietteen valmistaminen.
Turvallisuushuomautus: Silika- ja alumiinioksidipulverit ärsyttävät keuhkoja, ja niitä on aina käsiteltävä varovasti savuhuoneessa. Roiskunut pöly on hävitettävä moppaamalla se märällä paperipyyhkeellä (jos se on märkä, hienot hiukkaset eivät ole niin hajanaisia).
5) Kaada kolonnista mitattu adsorbentti savukaapissa Erlenmeyer-kolviin (kuva 4 b) ja lisää sitten hieman eluenttia (kuva 4 c). Tee löysä liete pyörittelemällä ja sekoittamalla lasisella sekoitussauvalla (kuva 4 d), kunnes kaikki adsorbentti on täysin märkää, kaasukuplat vapautuvat ja koostumus on hieman paksu, mutta valuva.
a) Lietteen kaataminen kolonniin, b) kolvin huuhtelu, c) kolonnin sivuille tarttunut adsorbentti, d) tarttuneen adsorbentin huuhtelu pois
6 ) Aseta dekantterilasi tai Erlenmeyer-pullo puristetun kolonnin alle ja avaa sulkuhana. Pyöritellään ja kaadetaan piidioksidi- tai alumiinioksidilietettä kolonniin yhdellä nopealla liikkeellä suurisuuksisen suppilon avulla (kuva 5 a). Huuhtele välittömästi lisää eluenttia huuhtelemalla lietteen jäännös Erlenmeyer-pullosta (kuva 5 b) kolonniin.
7) Huuhtele välittömästi mahdollinen piidioksidi tai alumiinioksidi pois kolonnin säiliön sivuilta käyttämällä eluenttia ja pyöritteleviä liikkeitä Pasteur-pipetillä (Kuva 5 c ja d). Jos adsorbentin annetaan kuivua, se tarttuu lasiin eikä sitä ole helppo huuhdella alas.
7) Huuhtele välittömästi mahdollinen piidioksidi tai alumiinioksidi pois kolonnin säiliön sivuilta käyttämällä eluenttia ja pyöritteleviä liikkeitä Pasteur-pipetillä (Kuva 5 c ja d). Jos adsorbentin annetaan kuivua, se tarttuu lasiin eikä sitä ole helppo huuhdella alas.
a) Pylvään töniminen ilmakuplien poistamiseksi, b) Ilmanpaineen käyttäminen, c) Hiekan lisääminen, d) Hiekan huuhteleminen sivuilta.
8) Työnnä kolonnia voimakkaasti korkkirenkaalla tai rystysilläsi (kuva 6 a), jotta kolonnissa olevat ilmakuplat (jotka voivat aiheuttaa huonoa erottumista tai adsorbentin halkeilua kolonnissa) saadaan poistettua ja jotta adsorbentti laskeutuu tasaisesti.
9) Paina kolonnin yläosaan (kuva 6 b) kevyesti ilmaa sen kokoonpuristamiseksi ja lopeta, kun eluentin taso on 1 cm:n päässä kolonnin yläosasta. Jos ilmalinjan kanssa käytetään T-sovitinta kuten kuvassa 6 b, ilmavirran hienosäätö voidaan toteuttaa säätämällä kumiletkun puristuspuristinta. Valkoinen adsorbenttikolonni on pidettävä märkänä koko eluutioprosessin ajan siten, että eluenttitaso on piidioksidin tai alumiinioksidin yläreunan yläpuolella. Murtakaa varovasti tiiviste, jotta paineen käyttö loppuu, ja sulkekaa sulkuhana, jotta neste ei pääse valumaan edelleen ulos.
10) Lisää ohut, noin 0,5 cm korkea kerros hiekkaa (kuva 6 c). Huuhtele kolonnin sivut eluentilla pyörivin liikkein, jotta hiekka irtoaa lasin sivuilta (kuva 6 d). Avataan sulkuhana ja annetaan nesteen tippua ulos, kunnes neste on juuri hiekkakerroksen yläpuolella. Käytä ilmanpainetta, jos tippuminen on liian hidasta.
9) Paina kolonnin yläosaan (kuva 6 b) kevyesti ilmaa sen kokoonpuristamiseksi ja lopeta, kun eluentin taso on 1 cm:n päässä kolonnin yläosasta. Jos ilmalinjan kanssa käytetään T-sovitinta kuten kuvassa 6 b, ilmavirran hienosäätö voidaan toteuttaa säätämällä kumiletkun puristuspuristinta. Valkoinen adsorbenttikolonni on pidettävä märkänä koko eluutioprosessin ajan siten, että eluenttitaso on piidioksidin tai alumiinioksidin yläreunan yläpuolella. Murtakaa varovasti tiiviste, jotta paineen käyttö loppuu, ja sulkekaa sulkuhana, jotta neste ei pääse valumaan edelleen ulos.
10) Lisää ohut, noin 0,5 cm korkea kerros hiekkaa (kuva 6 c). Huuhtele kolonnin sivut eluentilla pyörivin liikkein, jotta hiekka irtoaa lasin sivuilta (kuva 6 d). Avataan sulkuhana ja annetaan nesteen tippua ulos, kunnes neste on juuri hiekkakerroksen yläpuolella. Käytä ilmanpainetta, jos tippuminen on liian hidasta.
Lisätään näyte
Kun näyte on lisätty kolonniin, alkaa kilpajuoksu aikaa vastaan, sillä diffuusio alkaa laajentaa materiaalia. Näytettä ei pidä lisätä ennen kuin olet valmis täydentämään kolonnin välittömästi ja kokonaisuudessaan. Tämä prosessi voi kestää 15-90 minuuttia! Jos fraktioiden keräämiseen käytetään koeputkia, koeputket on järjestettävä telineeseen ennen näytteen lisäämistä, ja pylvään korkeus on säädettävä siten, että koeputkiteline voi liukua sen alle.
.
a) Kiinteän aineen liuottaminen pienellä määrällä dikloorimetaania, b) Näytteen lisääminen, c) Näytteen huuhteleminen kolvissa, d) Paineen kohdistaminen näytteen työntämiseksi kolonniin juuri hiekkakerroksen ohi.
a) Kiinteän aineen liuottaminen pienellä määrällä dikloorimetaania, b) Näytteen lisääminen, c) Näytteen huuhteleminen kolvissa, d) Paineen kohdistaminen näytteen työntämiseksi kolonniin juuri hiekkakerroksen ohi.
11) Jos raakanäyte on neste, käytä sitä suoraan (siirry vaiheeseen 13).
12) Jos raakanäyte on kiinteä, tee jokin seuraavista toimista.
12) Jos raakanäyte on kiinteä, tee jokin seuraavista toimista.
a) Ihanteellinen tilanne: liuotetaan kiinteä aine mahdollisimman pieneen määrään eluenttia (enintään muutama ml).
b) Jos kiinteä aine ei ole erityisen liukeneva tai ei liukene muutamaan ml:aan eluenttia, liuotetaan se vähimmäismäärään dikloorimetaania (enintään muutamaan ml:aan, kuva 7 a).
c) Jos kiinteä aine ei liukene eluenttiin, vaihtoehtoinen menettely on myös mahdollinen. Liuotetaan kiinteä aine pyöreäpohjaiseen kolviin käyttäen muutamia ml vähän kiehuvaa liuotinta (esim. dikloorimetaania tai asetonia). Lisätään kolviin noin 1 g piidioksidia tai alumiinioksidia ja poistetaan liuotin pyöröhaihduttimella, jolloin jäljelle jää kiinteä aine, joka sisältää adsorbentille laskeutuneen näytteen. Kun pakatun kolonnin päällä on tuuman verran eluenttia (hiekkakerroksen lisääminen jätetään väliin, jos tätä menetelmää käytetään), kaadetaan piidioksidia adsorboitunut näyte kolonniin laajasuisen suppilon avulla. Jos lasiin tarttuu pölyä, huuhtele se alas uudella eluentilla (siirry vaiheeseen 15).
13) Lisää näyte pylvääseen varovasti pipetillä tiputtamalla nestettä tai liuosta pipetin kärjellä suoraan hiekalle niin lähelle kuin mahdollista, ei sivuille (kuva 7 b). Varo, ettet ruiskuta nestettä väkisin niin, että hiekkaan tai piidioksidi-/alumiinapylvääseen syntyy painaumia.
14) Huuhtele näyteastia pienellä määrällä liuotinta (tai dikloorimetaania, jos sitä käytetään, kuva 7 c) ja lisää huuhteluaine pylvääseen käyttäen samaa pipettiä (huuhtele myös pipetti).
15) Avaa sulkuhana ja anna nesteen tippua ulos, kunnes näyte on juuri ja juuri hiekkakerroksen ohi (kuva 7 d) ja pylvään valkoiselle alueelle (käytä ilmanpainetta, jos tämä kestää yli 20 sekuntia).
16) Huuhtele kolonnin sivut varovasti pyörivin liikkein käyttäen 1-2 pipettitäyttä eluenttia huuhtelemaan roiskunut näyte. Anna jälleen nesteen tippua ulos (tai käytä ilmanpainetta), kunnes näyte on työntynyt valkoiseen adsorbenttiin.
Toista huuhteluvaihe, kunnes olet varma, että koko näyte on laskeutunut adsorbenttiin. Jos osa näytteestä on vielä hiekkakerroksessa, se voi liueta eluenttiin, kun liuotinta lisätään, jolloin saanto heikkenee. Jos yhdiste on värillinen, huuhtelun on oltava täysin kirkas.
14) Huuhtele näyteastia pienellä määrällä liuotinta (tai dikloorimetaania, jos sitä käytetään, kuva 7 c) ja lisää huuhteluaine pylvääseen käyttäen samaa pipettiä (huuhtele myös pipetti).
15) Avaa sulkuhana ja anna nesteen tippua ulos, kunnes näyte on juuri ja juuri hiekkakerroksen ohi (kuva 7 d) ja pylvään valkoiselle alueelle (käytä ilmanpainetta, jos tämä kestää yli 20 sekuntia).
16) Huuhtele kolonnin sivut varovasti pyörivin liikkein käyttäen 1-2 pipettitäyttä eluenttia huuhtelemaan roiskunut näyte. Anna jälleen nesteen tippua ulos (tai käytä ilmanpainetta), kunnes näyte on työntynyt valkoiseen adsorbenttiin.
Toista huuhteluvaihe, kunnes olet varma, että koko näyte on laskeutunut adsorbenttiin. Jos osa näytteestä on vielä hiekkakerroksessa, se voi liueta eluenttiin, kun liuotinta lisätään, jolloin saanto heikkenee. Jos yhdiste on värillinen, huuhtelun on oltava täysin kirkas.
a ja b) Liuotinsäiliön täyttäminen, c ja d) Kolonnin eluointi.
Täytä liuottimella ja eluoi pylväs.
17) Lisää eluenttia varovasti pipetillä (kuva 8 a), pyöritellen sivuja alaspäin, ja sitten kun hiekkakerros ei enää häiriintyisi lisäyksistä, kaada varovasti suurempia määriä (kuva 8 b) valmistettua eluenttia säiliön täyttämiseksi (tai täytä niin paljon kuin on tarpeen). Kolonnin pakkaamisen aikana kerätty puhdas eluentti voidaan käyttää uudelleen.
18 ) Eluoi näyte varovasti ja tasaisesti kolonnin läpi ilmanpaineen avulla (kuva 8 c ja d). Mitä useammin paine käynnistetään ja lopetetaan, sitä todennäköisemmin kolonni voi halkeilla. On parasta, jos paine voidaan pitää varovaisena ja tasaisena koko ajan.
Optimaalinen tippumisnopeus eluoinnin aikana riippuu kolonnin koosta. Ihanteellinen eluentin virtaus on, kun liuotin tippuu kolonnin sylinterimäisessä osassa adsorbentin yläpuolella 5 cm minuutissa. Siksi tippumisnopeuden pitäisi olla kapealla kolonnilla hitaampi kuin leveämmällä kolonnilla. Yhden tuuman kolonnin tippumisnopeuden pitäisi olla sellainen, että yksittäisiä pisaroita voidaan tuskin erottaa toisistaan. Tämän kokoisella kolonnilla sulkuhanasta ulos valuva nestevirta on hieman liian nopea.
18 ) Eluoi näyte varovasti ja tasaisesti kolonnin läpi ilmanpaineen avulla (kuva 8 c ja d). Mitä useammin paine käynnistetään ja lopetetaan, sitä todennäköisemmin kolonni voi halkeilla. On parasta, jos paine voidaan pitää varovaisena ja tasaisena koko ajan.
Optimaalinen tippumisnopeus eluoinnin aikana riippuu kolonnin koosta. Ihanteellinen eluentin virtaus on, kun liuotin tippuu kolonnin sylinterimäisessä osassa adsorbentin yläpuolella 5 cm minuutissa. Siksi tippumisnopeuden pitäisi olla kapealla kolonnilla hitaampi kuin leveämmällä kolonnilla. Yhden tuuman kolonnin tippumisnopeuden pitäisi olla sellainen, että yksittäisiä pisaroita voidaan tuskin erottaa toisistaan. Tämän kokoisella kolonnilla sulkuhanasta ulos valuva nestevirta on hieman liian nopea.
a-c) Jakeiden kerääminen, d) Kolonnin ajaminen.
Fraktioiden kerääminen
19) Aloitetaan välittömästi eluointinesteen kerääminen koeputkiin telineeseen (kuva 9 a). Katso kuvasta 1 suositukset kuhunkin koeputkeen kerättävistä määristä.20) Kun ensimmäinen koeputki täyttyy tai jos on kerätty tietty määrä nestettä ohjaajan tai kuvassa 1 esitettyjen suositusten mukaisesti, siirrä telineen paikkaa ja aloita keräys toiseen koeputkeen (kuvat 9 b ja c). Täytä ja pidä putket järjestyksessä telineessä.
Näitä eri putkia kutsutaan "fraktioiksi". Kolonnin tavoitteena on kerätä riittävän pieniä fraktioita, jotta useimmat (tai jotkut) fraktiot sisältävät puhdasta ainetta. Jos seoksen erottaminen on vaikeaa (jos komponenttien ΔRf on alhainen), voi olla parasta kerätä pieniä fraktioita (esim. puoliksi täytettyjä putkia).
Näitä eri putkia kutsutaan "fraktioiksi". Kolonnin tavoitteena on kerätä riittävän pieniä fraktioita, jotta useimmat (tai jotkut) fraktiot sisältävät puhdasta ainetta. Jos seoksen erottaminen on vaikeaa (jos komponenttien ΔRf on alhainen), voi olla parasta kerätä pieniä fraktioita (esim. puoliksi täytettyjä putkia).
a-c ) Kolonnin kärkeen roiskunut huuhteluaine, d) Opiskelijat ajavat kolonnia.
21 ) Kun neste valuu kolonnista, se roiskuu usein kolonnin kärjen ulkopinnoille, ja kun liuotin haihtuu, kärjessä saattaa näkyä materiaalirengas (näet kiinteän aineen renkaan, jos komponentti on kiinteä, kuten kuvassa 10 b, tai öljyisiä pisaroita, jos komponentti on neste). Jos komponentit ovat värillisiä, pylvään kärki on huuhdeltava (kuva 10 c), kun näyttää siltä, että yksi komponentti on eluoitunut kokonaan ja ennen kuin toinen komponentti lähestyy.
22) Tarkkaile määräajoin eluentin tasoa ja täytä se uudelleen ennen kuin se laskee hiekkakerroksen alapuolelle.
22) Tarkkaile määräajoin eluentin tasoa ja täytä se uudelleen ennen kuin se laskee hiekkakerroksen alapuolelle.
a) Eluutio, b) Etyyliasetaatin lisääminen liuottimen polaarisuuden lisäämiseksi, c) Liuottimen taso lähestyy hiekkakerrosta, d) Täyttö uudelleen.
Mahdollisesti liuottimen polaarisuuden lisääminen
23) Yhtä eluenttia voidaan käyttää koko kolonnissa, varsinkin jos erotettavilla komponenteilla on samanlaiset Rf-arvot. Jos komponenttien Rf-arvot ovat kuitenkin hyvin erilaiset, liuottimen napaisuutta voidaan lisätä sen jälkeen, kun yksi komponentti on eluoitunut kolonnista (kuva 11 a).
Liuottimen polariteetin lisääminen saa komponentit kulkemaan "nopeammin". Nopeampaa eluoitumista halutaan useista syistä. Ensinnäkin, jos yksi komponentti on jo poistunut kolonnista, kolonni on jo tehnyt tehtävänsä erottelussa, joten prosessin nopeuttaminen ei vaikuta kerättyjen jakeiden puhtauteen. Toiseksi, mitä kauemmin kolonnin ajaminen kestää, sitä leveämmät komponenttikaistat ovat (diffuusion vuoksi), ja laajan kaistan materiaalin kerääminen kuluttaa (ja hukkaa) paljon liuotinta.
Liuottimen polariteetin lisääminen saa komponentit kulkemaan "nopeammin". Nopeampaa eluoitumista halutaan useista syistä. Ensinnäkin, jos yksi komponentti on jo poistunut kolonnista, kolonni on jo tehnyt tehtävänsä erottelussa, joten prosessin nopeuttaminen ei vaikuta kerättyjen jakeiden puhtauteen. Toiseksi, mitä kauemmin kolonnin ajaminen kestää, sitä leveämmät komponenttikaistat ovat (diffuusion vuoksi), ja laajan kaistan materiaalin kerääminen kuluttaa (ja hukkaa) paljon liuotinta.
Sisältää osittaisen luettelon eluotrooppisista sarjoista, luettelon yleisimmistä liuottimista, jotka on järjestetty niiden "liuotinvoiman" mukaan normaalifaasikromatografiassa. Mitä polaarisempi liuotin on, sitä jyrkimmin kasvaa Rf-arvo.
24 ) Liuottimen polaarisuuden lisäämiseksi polaarista liuotinta voidaan tiputtaa suoraan eluenttiin kolonnin säiliössä (kuva 11 b). Esimerkiksi jos käytetään heksaani:etyyliasetaatti-seosta, puhtaan etyyliasetaatin lisääminen säiliössä olevaan eluenttiin lisää sen polaarisuutta. Jos eluentin määrä on vähissä, voidaan valmistaa liuos, joka sisältää suuremman prosenttiosuuden poolisempaa komponenttia. Esimerkiksi jos kolonnissa käytettiin ensin 4:1 heksaani:etyyliasetaatti -seosta, 1:1 seoksen käyttäminen olisi poolisempi liuotin.
25) Eluoi kolonni polaarisemmalla liuottimella kuten aiemmin, ja muista aina tarkkailla eluentin tasoa ja täyttää se uudelleen (kuva 11 d) ennen kuin se laskee hiekkakerroksen alapuolelle.
26 ) Jos haluat lisätä liuottimen polaarisuutta, polaarista liuotinta voidaan tiputtaa suoraan pylvään säiliössä olevaan eluenttiin (kuva 11 b). Jos käytetään esimerkiksi heksaani:etyyliasetaatti-seosta, puhtaan etyyliasetaatin lisääminen säiliössä tällä hetkellä olevaan eluenttiin lisäisi sen polaarisuutta. Jos eluentin määrä on vähissä, voidaan valmistaa liuos, joka sisältää suuremman prosenttiosuuden poolisempaa komponenttia. Esimerkiksi jos kolonnissa käytettiin ensin 4:1 heksaani:etyyliasetaatti -seosta, 1:1 seoksen käyttäminen olisi poolisempi liuotin.
27) Eluoidaan kolonni polaarisemmalla liuottimella kuten aiemmin, ja muistetaan aina tarkkailla eluentin tasoa ja täyttää se uudelleen (kuva 11 d) ennen kuin se laskee hiekkakerroksen alapuolelle.
25) Eluoi kolonni polaarisemmalla liuottimella kuten aiemmin, ja muista aina tarkkailla eluentin tasoa ja täyttää se uudelleen (kuva 11 d) ennen kuin se laskee hiekkakerroksen alapuolelle.
26 ) Jos haluat lisätä liuottimen polaarisuutta, polaarista liuotinta voidaan tiputtaa suoraan pylvään säiliössä olevaan eluenttiin (kuva 11 b). Jos käytetään esimerkiksi heksaani:etyyliasetaatti-seosta, puhtaan etyyliasetaatin lisääminen säiliössä tällä hetkellä olevaan eluenttiin lisäisi sen polaarisuutta. Jos eluentin määrä on vähissä, voidaan valmistaa liuos, joka sisältää suuremman prosenttiosuuden poolisempaa komponenttia. Esimerkiksi jos kolonnissa käytettiin ensin 4:1 heksaani:etyyliasetaatti -seosta, 1:1 seoksen käyttäminen olisi poolisempi liuotin.
27) Eluoidaan kolonni polaarisemmalla liuottimella kuten aiemmin, ja muistetaan aina tarkkailla eluentin tasoa ja täyttää se uudelleen (kuva 11 d) ennen kuin se laskee hiekkakerroksen alapuolelle.
a) Alkuperäinen TLC-levy, b) Kolonnin keräämät fraktiot, c) Fraktioiden tiputtaminen TLC-levylle, d ) visualisoitu TLC-levy kunkin fraktion näytteistä.
Halutun komponentin löytäminen ja konsentrointi
28 ) Halutun komponentin löytämisessä koeputkifraktioista on hyödyllistä ymmärtää Rf:n ja eluointijärjestyksen välinen suhde kolonnikromatografiassa.Pylväskromatografiassa näyte laskeutuu pylvästä johtavaksi ja eluoituu alaspäin, kun taas ohutkerroskromatografiassa näyte laikutetaan levyn pohjalle ja eluoituu ylöspäin. Näin ollen kolonni voidaan ajatella ylösalaisin olevana TLC-levynä. Yhdiste, jonka Rf-arvo on korkeampi, kulkee "nopeammin", eli se päätyy TLC-levylle korkeammalle, ja se kerätään ensin kolonnilla. Tässä kohdassa kuvatussa kolonnissa komponentti, jolla on matalampi Rf (oranssi TLC-levyllä kuvassa 13 a), on se komponentti, joka kerätään kolonnista toisena.
29) Määritä ensin, mitkä koeputket sisältävät liuennutta yhdistettä.
29) Määritä ensin, mitkä koeputket sisältävät liuennutta yhdistettä.
a) Pistetään näyte kustakin fraktiosta TLC-levylle, joka on merkitty fraktioiden numeroilla, jotka vastaavat järjestystä, jossa ne kerättiin (kuva 13 c). Saattaa olla parasta pistää kukin näyte 2-3 kertaa päällekkäin, jos jakeet ovat laimeita.
b) Jos on kerätty monia fraktioita, minkä vuoksi epäröit ottaa näytettä jokaisesta fraktiosta, yksi tapa tunnistaa värittömät fraktiot, jotka saattavat sisältää yhdistettä, on etsiä koeputkia johtavia jäännöksiä. Haihduttamisen jälkeen koeputken yläosaan jää joskus kiinteä jäännös (kuva 13) tai öljyisiä pisaroita, mikä tekee ilmeiseksi, että nämä jakeet sisältävät muutakin kuin pelkkää liuotinta. Otetaan näyte kaikista näkyvää jäännöstä sisältävien putkien lähellä olevista jakeista.
.
c) Visualisoidaan täplikäs TLC-levy UV-valon ja/tai väriaineen avulla, jotta voidaan määrittää, mitkä fraktiot sisältävät yhdistettä (kuva 13 d).
c) Visualisoidaan täplikäs TLC-levy UV-valon ja/tai väriaineen avulla, jotta voidaan määrittää, mitkä fraktiot sisältävät yhdistettä (kuva 13 d).
a) Mahdollista yhdistettä sisältävien fraktioiden eluoituneet TLC-levyt, b) Fraktioiden yhdistäminen, c) Fraktioputken huuhtelu.
28) Suorita TLC kaikista yhdisteen sisältävistä fraktioista, pilkuttamalla enintään viisi näytettä 2,5 cm:n levyistä TLC-levyä kohti. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää leveämpiä TLC-levyjä, jos niitä on käytettävissä.
29 ) Tunnistetaan yhdiste, jolla on haluttu Rf, vertaamalla sitä alkuperäiseen raakamateriaalin TLC-levyyn. Valitaan ne fraktiot, joissa haluttu yhdiste on puhtaassa muodossa, kuten eluoitunut TLC-levy osoittaa. Jos esimerkiksi kuvassa 15 a halutaan yhdiste, jolla on korkeampi Rf, fraktiot 6-10 olisi säilytettävä.
30) Yhdistetään puhtaat fraktiot sopivan kokoiseen pyöreäpohjaiseen kolviin (enintään puolitäyteen, kuva 15 b). Huuhtele jokainen koeputki pienellä määrällä eluenttia (tai muuta liuotinta, jos liukoisuus on ongelma) ja lisää huuhteluaines pyöreäpohjaiseen kolviin (kuva 15 c).
31) Haihduta liuotin pyöröhaihduttimella, jotta puhdistettu yhdiste jää kolviin.
29 ) Tunnistetaan yhdiste, jolla on haluttu Rf, vertaamalla sitä alkuperäiseen raakamateriaalin TLC-levyyn. Valitaan ne fraktiot, joissa haluttu yhdiste on puhtaassa muodossa, kuten eluoitunut TLC-levy osoittaa. Jos esimerkiksi kuvassa 15 a halutaan yhdiste, jolla on korkeampi Rf, fraktiot 6-10 olisi säilytettävä.
30) Yhdistetään puhtaat fraktiot sopivan kokoiseen pyöreäpohjaiseen kolviin (enintään puolitäyteen, kuva 15 b). Huuhtele jokainen koeputki pienellä määrällä eluenttia (tai muuta liuotinta, jos liukoisuus on ongelma) ja lisää huuhteluaines pyöreäpohjaiseen kolviin (kuva 15 c).
31) Haihduta liuotin pyöröhaihduttimella, jotta puhdistettu yhdiste jää kolviin.
a) Kolonnin kuivattaminen ilmanpaineen avulla, b) Kolonnin annetaan kuivua ylösalaisin, c) Jätteeksi jääneen piidioksidin kerääminen.
Kolonnin puhdistaminen
32 ) Kuivaa kolonni käyttämällä ilmanpainetta, jotta suurin osa eluentista valuu kolonnista jäteastiaan. Kuivaa sitten kolonni edelleen jollakin seuraavista menetelmistä.
a) Jätä kytketty varovainen ilmavirta kulkemaan kolonnin läpi sen kuivattamiseksi edelleen, kun siivoat muita asioita (kuva 16 a).
b) Kiinnitä kolonni ylösalaisin suuren jätelasin päälle huurrehuoneeseen, jotta adsorbentti putoaa, kun se on kuivunut (kuva 16 b). Tämä vie kauan aikaa (seuraavaan oppituntiin asti), mutta on yksi vaihtoehto.
33 ) Kun adsorbentti on kuivunut, se voidaan kaataa pylväästä huurteenpoistossa olevaan jäteastiaan (kuva 16 c).
Turvallisuushuomautus: Jauhemaiset adsorbentit ärsyttävät keuhkoja, ja niiden vaara pahenee, jos kolonnissa on jäännösyhdisteitä, jotka voivat nyt päästä keuhkoihin. Piidioksidi- tai alumiinioksidijauheiden kaataminen on aina tehtävä huurresuojassa.
34) Kun suurin osa adsorbentista on kerätty jäteastiaan, huuhtele vedellä kaikki jäännösjäännökset tiskialtaaseen ja huuhtele kolonni asetonilla jätelasiin. Puhdista lisäksi kolonni saippualla ja vedellä ja kuivaa se siten, että sulkuhanan osat ovat erillään.
Turvallisuushuomautus: Jauhemaiset adsorbentit ärsyttävät keuhkoja, ja niiden vaara pahenee, jos kolonnissa on jäännösyhdisteitä, jotka voivat nyt päästä keuhkoihin. Piidioksidi- tai alumiinioksidijauheiden kaataminen on aina tehtävä huurresuojassa.
34) Kun suurin osa adsorbentista on kerätty jäteastiaan, huuhtele vedellä kaikki jäännösjäännökset tiskialtaaseen ja huuhtele kolonni asetonilla jätelasiin. Puhdista lisäksi kolonni saippualla ja vedellä ja kuivaa se siten, että sulkuhanan osat ovat erillään.
Vianmääritys
Kolonnissa näkyy ilmakuplia
Ilmakupla on tyhjä tasku, jossa paikallaan olevan ja liikkuvan faasin tasapainottuminen ei tapahdu, joten komponentit liikkuvat ilmakuplan ympärillä nopeammin kuin niiden pitäisi. Tämä voi johtaa epätasaisiin eluoituviin kaistoihin, jotka voivat aiheuttaa päällekkäisyyttä, jos seoksen erottaminen on vaikeaa (jos komponenttien Rf-arvot ovat hyvin lähellä toisiaan, kuten kuvassa 17).
.
Jos kolonnissa näkyy ilmakuplia eikä hiekkaa tai näytettä ole vielä levitetty, anna kolonnille kunnon tönäisy pakkaamisen aikana, jotta kaikki ilmakuplat saadaan poistettua. Ota yhteyttä ohjaajaan, jos kuplat eivät liiku, sillä saatat lähestyä tehtävää liian varovaisesti. Jos hiekka tai näyte on jo levitetty, on parasta jättää kolonni sellaisenaan ja toivoa, etteivät ilmakuplat vaikuta erotteluun.
Bändit eluoituvat epätasaisesti
Jos seoksen komponentit ovat värillisiä, se voi näkyä selvästi, kun kaistat eluoituvat vinosti. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että kolonni on puristettu hieman vinoon. Jos kolonni on kiinnitetty vinosti, komponentit kulkeutuvat vinosti (kuva 18). Tämä voi aiheuttaa erottumisongelmia, jos komponenteilla on samanlainen Rf.
.
Tätä ongelmaa ei voida ratkaista pylvään puolivälissä, mutta jos komponenteilla on hyvin erilaiset Rf-arvot, vinot kaistat eivät välttämättä vaikuta erottumiseen. Varmista jatkossa, että pylväs on täysin pystysuorassa sekä sivulta-sivulle että edestä-taakse-suunnassa.
Last edited by a moderator:
