Εισαγωγή
Η χρωματογραφία στήλης είναι μια επέκταση της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC). Θεωρείται ότι ο αναγνώστης έχει κάποια εμπειρία στην εργαστηριακή πρακτική και έχει ασχοληθεί με τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. Αντί να εφαρμόζεται ένα δείγμα σε ένα λεπτό στρώμα πυριτίας ή αλουμίνας, ένα δείγμα εναποτίθεται σε έναν κύλινδρο προσροφητικού υλικού και ο διαλύτης εφαρμόζεται συνεχώς με πίεση μέχρι να στραγγίσουν πλήρως τα συστατικά από τον κύλινδρο. Με αυτή την τροποποίηση, τα συστατικά μπορούν όχι μόνο να διαχωριστούν αλλά και να συλλεχθούν σε διαφορετικά δοχεία, επιτρέποντας τον καθαρισμό μιγμάτων και τον διαχωρισμό φαρμάκων με ρύπους. Η χρωματογραφία στήλης (επίσης γνωστή ως "χρωματογραφία λάμψης"), χρησιμοποιείται συχνά σε ερευνητικά περιβάλλοντα, όπως αποδεικνύεται από τη συχνή εμφάνισή της στα διαδικαστικά τμήματα άρθρων περιοδικών.
Διαδικαστική συζήτηση
Οι ίδιες βασικές αρχές της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) ισχύουν και για τη χρωματογραφία στήλης. Στην πραγματικότητα, μια TLC εκτελείται πάντα πριν από την εκτέλεση μιας στήλης για την αξιολόγηση της κατάστασης και τον προσδιορισμό της κατάλληλης αναλογίας διαλυτών. Για να επιτευχθεί καλός διαχωρισμός, είναι ιδανικό εάν το επιθυμητό συστατικό έχει Rf περίπου 0,35 (διαβάστε σχετικά με το Rf στο θέμα TLC) και διαχωρίζεται από τα άλλα συστατικά κατά τουλάχιστον 0,2 μονάδες Rf. Εάν οι κηλίδες που πρόκειται να διαχωριστούν είναι πολύ κοντά (εάν η διαφορά στο Rf είναι < 0,2), είναι καλύτερο εάν η μέση των κηλίδων έχει Rf 0,35. Ένα Rf κοντά στο 0,35 είναι ιδανικό, διότι είναι αρκετά αργό ώστε να μπορεί να συμβεί εξισορρόπηση σταθερής-κινητής φάσης, αλλά αρκετά γρήγορο ώστε να ελαχιστοποιηθεί η διεύρυνση της ζώνης από τη διάχυση.
Υπάρχουν μερικές μεταβλητές που δεν εφαρμόζονται στην TLC, αλλά επηρεάζουν τον διαχωρισμό των συστατικών στη χρωματογραφία στήλης. Σε αυτές περιλαμβάνονται η διάμετρος της στήλης, η ποσότητα του προσροφητικού που χρησιμοποιείται και ο ρυθμός ροής του διαλύτη. Εικ. 1 παρουσιάζουν συστάσεις μεταβλητών με βάση το μέγεθος του δείγματος και τον βαθμό διαχωρισμού μεταξύ των συστατικών. Σε όλα τα σενάρια, οι στήλες πρέπει να προετοιμάζονται σε ύψος μεταξύ 12,5-15 cm.
Υπάρχουν μερικές μεταβλητές που δεν εφαρμόζονται στην TLC, αλλά επηρεάζουν τον διαχωρισμό των συστατικών στη χρωματογραφία στήλης. Σε αυτές περιλαμβάνονται η διάμετρος της στήλης, η ποσότητα του προσροφητικού που χρησιμοποιείται και ο ρυθμός ροής του διαλύτη. Εικ. 1 παρουσιάζουν συστάσεις μεταβλητών με βάση το μέγεθος του δείγματος και τον βαθμό διαχωρισμού μεταξύ των συστατικών. Σε όλα τα σενάρια, οι στήλες πρέπει να προετοιμάζονται σε ύψος μεταξύ 12,5-15 cm.
Για παράδειγμα, μια στήλη 2,5 cm θα πρέπει να είναι σε θέση να καθαρίσει περίπου 400 mg υλικού εάν ο διαχωρισμός είναι καλός (ΔRf > 0,2, τρίτη στήλη στην Εικ. 1), ή περίπου 160 mg εάν ο διαχωρισμός είναι δύσκολος (ΔRf > 0,1). Η στήλη θα πρέπει να μπορεί να προετοιμαστεί και να εκλουστεί χρησιμοποιώντας περίπου 200 ml διαλύτη και τα κλάσματα μπορούν να συλλεχθούν με περίπου 10 ml διαλύματος το καθένα.
Υπάρχουν πολλαπλές παραλλαγές σχετικά με τον τρόπο φυσικής λειτουργίας μιας στήλης. Μια μεγάλη διαφορά στις μεθόδους είναι ο τρόπος προετοιμασίας της στήλης. Στη μέθοδο "ξηρής συσκευασίας", ξηρή πυριτία ή αλουμίνα προστίθεται απευθείας σε μια στήλη και ο διαλύτης αφήνεται να διαρρεύσει τμηματικά και στη συνέχεια με πίεση. Στη μέθοδο "υγρής συσκευασίας", η στήλη γεμίζεται πρώτα με διαλύτη, στη συνέχεια ανακινείται ελαφρά η ξηρή πυριτία ή αλουμίνα και στη συνέχεια συσκευάζεται με πίεση. Στη μέθοδο "πολτού", ο διαλύτης προστίθεται στη σιλικόνη ή την αλουμίνα σε φιάλη Erlenmeyer, χύνεται στη στήλη ως πολτός και στη συνέχεια συσκευάζεται με πίεση (η πίεση μπορεί να παραχθεί με σύριγγα).
Είναι σημαντικό να γνωρίζετε ότι απελευθερώνεται θερμότητα όταν προστίθεται διαλύτης στη σιλικόνη ή την αλουμίνα (έχουν εξώθερμη θερμότητα διαλυτοποίησης). Σε αυτή την ενότητα παρουσιάζεται η μέθοδος του πολτού, με κύριο λόγο ότι επιτρέπει αυτό το εξώθερμο βήμα να συμβεί σε φιάλη Erlenmeyer αντί στη στήλη. Εάν απελευθερωθεί θερμότητα κατά τη συσκευασία της στήλης, μπορεί να δημιουργηθούν φυσαλίδες από τον βρασμό του διαλύτη. Αυτές μπορούν να παρεμποδίσουν το διαχωρισμό της στήλης, εάν δεν απομακρυνθούν επαρκώς, και μπορούν να ραγίσουν το προσροφητικό υλικό της στήλης.
Υπάρχουν πολλαπλές παραλλαγές σχετικά με τον τρόπο φυσικής λειτουργίας μιας στήλης. Μια μεγάλη διαφορά στις μεθόδους είναι ο τρόπος προετοιμασίας της στήλης. Στη μέθοδο "ξηρής συσκευασίας", ξηρή πυριτία ή αλουμίνα προστίθεται απευθείας σε μια στήλη και ο διαλύτης αφήνεται να διαρρεύσει τμηματικά και στη συνέχεια με πίεση. Στη μέθοδο "υγρής συσκευασίας", η στήλη γεμίζεται πρώτα με διαλύτη, στη συνέχεια ανακινείται ελαφρά η ξηρή πυριτία ή αλουμίνα και στη συνέχεια συσκευάζεται με πίεση. Στη μέθοδο "πολτού", ο διαλύτης προστίθεται στη σιλικόνη ή την αλουμίνα σε φιάλη Erlenmeyer, χύνεται στη στήλη ως πολτός και στη συνέχεια συσκευάζεται με πίεση (η πίεση μπορεί να παραχθεί με σύριγγα).
Είναι σημαντικό να γνωρίζετε ότι απελευθερώνεται θερμότητα όταν προστίθεται διαλύτης στη σιλικόνη ή την αλουμίνα (έχουν εξώθερμη θερμότητα διαλυτοποίησης). Σε αυτή την ενότητα παρουσιάζεται η μέθοδος του πολτού, με κύριο λόγο ότι επιτρέπει αυτό το εξώθερμο βήμα να συμβεί σε φιάλη Erlenmeyer αντί στη στήλη. Εάν απελευθερωθεί θερμότητα κατά τη συσκευασία της στήλης, μπορεί να δημιουργηθούν φυσαλίδες από τον βρασμό του διαλύτη. Αυτές μπορούν να παρεμποδίσουν το διαχωρισμό της στήλης, εάν δεν απομακρυνθούν επαρκώς, και μπορούν να ραγίσουν το προσροφητικό υλικό της στήλης.
Διαδικασίες βήμα προς βήμα
α) TLC του μίγματος σιδηροκενίου/ακετυλοφερροκενίου, β) χρωματογραφία στήλης
Η στήλη που απεικονίζεται σε αυτό το τμήμα δείχνει τον καθαρισμό ενός δείγματος 0,20 g που περιέχει μείγμα σιδηροκενίου και ακετυλοφερροκενίου (η ακατέργαστη TLC είναι στο Σχ. 2 α). Περίπου 8mL κλασμάτων συλλέχθηκαν σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες και χρησιμοποιήθηκαν περίπου 400 ml εκλουόμενου.
α) Πλάκα TLC του ακατέργαστου μίγματος σιδηροκενίου/ακετυλοφερροκενίου πριν από την έκλουση, β) Μετά την έκλουση, γ) Στήλη με φρίτα, δ) Στήλη με βαμβάκι σφηνωμένο στον πυθμένα, ε) Στήλη χωρίς τη σφήνα βαμβακιού (θα πρέπει να τοποθετηθεί πριν από τη χρήση)
Εκτέλεση TLC
1) Εκτελέστε μια TLC στο δείγμα που πρόκειται να καθαριστεί (Εικ. 3 α και β) για να προσδιορίσετε τον κατάλληλο διαλύτη για τη χρωματογραφία. Το επιθυμητό συστατικό θα πρέπει να έχει Rf περίπου 0,35 και ιδανικά θα πρέπει να διαχωρίζεται από όλα τα άλλα σημεία κατά τουλάχιστον 0,2 μονάδες Rf.
2) Προετοιμάστε μια παρτίδα εκλυτικού μέσου που δίνει την κατάλληλη τιμή Rf. Η ποσότητα που παρασκευάζεται εξαρτάται από την ποσότητα του δείγματος, το μέγεθος της στήλης και από το αν προβλέπεται να αλλάξει η σύνθεση του διαλύτη στη μέση της διαδικασίας. (Βλέπε το Σχήμα 1 για κατευθυντήριες γραμμές και τη σειρά ελουοτρόπων για τις τάσεις της "ισχύος του διαλύτη").
2) Προετοιμάστε μια παρτίδα εκλυτικού μέσου που δίνει την κατάλληλη τιμή Rf. Η ποσότητα που παρασκευάζεται εξαρτάται από την ποσότητα του δείγματος, το μέγεθος της στήλης και από το αν προβλέπεται να αλλάξει η σύνθεση του διαλύτη στη μέση της διαδικασίας. (Βλέπε το Σχήμα 1 για κατευθυντήριες γραμμές και τη σειρά ελουοτρόπων για τις τάσεις της "ισχύος του διαλύτη").
Προετοιμασία της συσκευασμένης στήλης
3) Προμηθευτείτε μια κατάλληλη στήλη (βλ. Σχ. 1) και βεβαιωθείτε ότι υπάρχει κάτι κοντά στο βύσμα που θα επιτρέπει τη διέλευση υγρού, αλλά όχι στερεού. Οι στήλες μπορεί να έχουν έναν πυροσυσσωματωμένο δίσκο (γνωστό και ως "frit"), Σχ. 3 γ), ή ένα πώμα από βαμβάκι ή υαλοβάμβακα που έχει απομείνει από τον προηγούμενο χρήστη (Σχ. 3 δ). Εάν δεν υπάρχει δίσκος ή πώμα (Εικ. 3 ε), σφηνώστε ένα μικρό κομμάτι βαμβάκι ή υαλοβάμβακα στον πυθμένα της στήλης χρησιμοποιώντας μια μακριά ράβδο.
α) Χύση πυριτίας σε ύψος 12,5-15 cm στον απορροφητήρα, β) Χύση της πυριτίας σε φιάλη Erlenmeyer, γ και δ) Παραγωγή πολτού
Σημείωση ασφαλείας: Η πυριτία σε σκόνη και η αλουμίνα είναι ερεθιστικά για τους πνεύμονες και πρέπει πάντα να χειρίζονται προσεκτικά σε απορροφητήρα. Η σκόνη που έχει χυθεί πρέπει να απορρίπτεται με σφουγγάρισμα με μια υγρή χαρτοπετσέτα (αν είναι υγρή, τα λεπτά σωματίδια είναι λιγότερο διασκορπισμένα).
5) Στον απορροφητήρα, ρίξτε το προσροφητικό που μετρήθηκε στη στήλη σε μια φιάλη Erlenmeyer (Σχ. 4 β) και, στη συνέχεια, προσθέστε λίγο εκλυτικό (Σχ. 4 γ). Φτιάξτε ένα χαλαρό πολτό αναδεύοντας και ανακατεύοντας με μια γυάλινη ράβδο ανάδευσης (Εικ.4 δ) έως ότου όλο το προσροφητικό είναι εντελώς υγρό, απελευθερωθούν φυσαλίδες αερίου και η σύσταση είναι κάπως παχύρρευστη, αλλά χυτή.
α) Χύση του αιωρήματος στη στήλη, β) ξέπλυμα της φιάλης, γ) προσροφητικό προσκολλημένο στις πλευρές της στήλης, δ) ξέπλυμα του προσκολλημένου προσροφητικού
6) Τοποθετήστε ένα ποτήρι ζέσεως ή μια φιάλη Erlenmeyer κάτω από τη σφιγμένη στήλη και ανοίξτε τη στρόφιγγα. Με μια γρήγορη κίνηση, αναδεύστε και ρίξτε το αιώρημα πυριτίας ή αλουμίνας στη στήλη χρησιμοποιώντας ένα χωνί με μεγάλο στόμιο (Εικ. 5 α). Χρησιμοποιήστε αμέσως περισσότερο εκλουόμενο για να ξεπλύνετε το υπόλοιπο αιώρημα από τη φιάλη Erlenmeyer (Εικ. 5 β) και πάνω στη στήλη.
7) Ξεπλύνετε αμέσως τυχόν πυρίτιο ή αλουμίνα από τις πλευρές της δεξαμενής της στήλης χρησιμοποιώντας εκλουστικό υγρό και μια στροβιλιστική κίνηση από μια πιπέτα Pasteur (Εικ. 5 γ και δ). Εάν αφεθεί να στεγνώσει, το προσροφητικό υλικό θα προσκολληθεί στο γυαλί και δεν θα ξεπλυθεί εύκολα.
7) Ξεπλύνετε αμέσως τυχόν πυρίτιο ή αλουμίνα από τις πλευρές της δεξαμενής της στήλης χρησιμοποιώντας εκλουστικό υγρό και μια στροβιλιστική κίνηση από μια πιπέτα Pasteur (Εικ. 5 γ και δ). Εάν αφεθεί να στεγνώσει, το προσροφητικό υλικό θα προσκολληθεί στο γυαλί και δεν θα ξεπλυθεί εύκολα.
α) Σπρώξιμο της στήλης για την απομάκρυνση των φυσαλίδων αέρα, β) Εφαρμογή πίεσης αέρα, γ) Προσθήκη άμμου, δ) Ξέπλυμα άμμου από τις πλευρές
8) Σπρώξτε τη στήλη σταθερά χρησιμοποιώντας έναν δακτύλιο φελλού ή τις αρθρώσεις των αρθρώσεών σας (Εικ. 6 α) για να απομακρύνετε τυχόν φυσαλίδες αέρα στη στήλη (οι οποίες θα μπορούσαν να προκαλέσουν κακό διαχωρισμό ή ρωγμές του προσροφητικού στη στήλη) και για να προωθήσετε την ομοιόμορφη εναπόθεση του προσροφητικού.
9) Εφαρμόστε ήπια πίεση αέρα στην κορυφή της στήλης (Σχ. 6 β) για να τη συμπιέσετε, σταματώντας όταν η στάθμη του εκλουόμενου είναι 1 cm από την κορυφή της στήλης. Εάν χρησιμοποιείται προσαρμογέας Τ με τη γραμμή αέρα, όπως στην Εικ. 6 β, ο λεπτός έλεγχος της ροής του αέρα μπορεί να επιτευχθεί με τη ρύθμιση του σφιγκτήρα τσίμπησης στον ελαστικό σωλήνα. Καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας έκλουσης, διατηρήστε τη λευκή στήλη προσροφητικού υγρή, με το επίπεδο έκλουσης πάνω από την κορυφή της πυριτίας ή της αλουμίνας. Σπάστε απαλά τη σφράγιση για να σταματήσετε την εφαρμογή της πίεσης και κλείστε τη στρόφιγγα για να αποτρέψετε την περαιτέρω σταγονοποίηση του υγρού.
10) Προσθέστε ένα λεπτό στρώμα άμμου (Σχ. 6 γ), ύψους περίπου 0,5 cm. Ξεπλύνετε τις πλευρές της στήλης με εκλουόμενο υγρό χρησιμοποιώντας μια στροβιλιστική κίνηση για να απομακρύνετε την άμμο από τις πλευρές του γυαλιού (Εικ.6 δ). Ανοίξτε τη στρόφιγγα και αφήστε το υγρό να στάξει μέχρι το υγρό να βρίσκεται ακριβώς πάνω από το στρώμα άμμου. Εφαρμόστε πίεση αέρα εάν η σταγονορροή είναι πολύ αργή.
9) Εφαρμόστε ήπια πίεση αέρα στην κορυφή της στήλης (Σχ. 6 β) για να τη συμπιέσετε, σταματώντας όταν η στάθμη του εκλουόμενου είναι 1 cm από την κορυφή της στήλης. Εάν χρησιμοποιείται προσαρμογέας Τ με τη γραμμή αέρα, όπως στην Εικ. 6 β, ο λεπτός έλεγχος της ροής του αέρα μπορεί να επιτευχθεί με τη ρύθμιση του σφιγκτήρα τσίμπησης στον ελαστικό σωλήνα. Καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας έκλουσης, διατηρήστε τη λευκή στήλη προσροφητικού υγρή, με το επίπεδο έκλουσης πάνω από την κορυφή της πυριτίας ή της αλουμίνας. Σπάστε απαλά τη σφράγιση για να σταματήσετε την εφαρμογή της πίεσης και κλείστε τη στρόφιγγα για να αποτρέψετε την περαιτέρω σταγονοποίηση του υγρού.
10) Προσθέστε ένα λεπτό στρώμα άμμου (Σχ. 6 γ), ύψους περίπου 0,5 cm. Ξεπλύνετε τις πλευρές της στήλης με εκλουόμενο υγρό χρησιμοποιώντας μια στροβιλιστική κίνηση για να απομακρύνετε την άμμο από τις πλευρές του γυαλιού (Εικ.6 δ). Ανοίξτε τη στρόφιγγα και αφήστε το υγρό να στάξει μέχρι το υγρό να βρίσκεται ακριβώς πάνω από το στρώμα άμμου. Εφαρμόστε πίεση αέρα εάν η σταγονορροή είναι πολύ αργή.
Προσθέστε το δείγμα
Μόλις εφαρμοστεί το δείγμα στη στήλη, γίνεται αγώνας δρόμου με το χρόνο, καθώς η διάχυση θα αρχίσει να διευρύνει το υλικό. Το δείγμα δεν πρέπει να εφαρμόζεται μέχρι να είστε έτοιμοι να ολοκληρώσετε τη στήλη αμέσως και στο σύνολό της. Αυτή η διαδικασία μπορεί να διαρκέσει από 15 έως 90 λεπτά! Εάν χρησιμοποιείτε δοκιμαστικούς σωλήνες για τη συλλογή κλασμάτων, οι δοκιμαστικοί σωλήνες θα πρέπει να τοποθετηθούν σε ένα ράφι πριν από την προσθήκη του δείγματος και το ύψος της στήλης θα πρέπει να ρυθμιστεί έτσι ώστε το ράφι των δοκιμαστικών σωλήνων να μπορεί να γλιστρήσει από κάτω.
α) Διάλυση ενός στερεού με μικρή ποσότητα διχλωρομεθανίου, β) Εφαρμογή του δείγματος, γ) Ξέπλυμα του δείγματος στη φιάλη του, δ) Εφαρμογή πίεσης για την ώθηση του δείγματος στη στήλη ακριβώς μετά το στρώμα άμμου
11) Εάν το ακατέργαστο δείγμα είναι υγρό, χρησιμοποιήστε το απευθείας (συνεχίστε στο βήμα 13).
12) Εάν το ακατέργαστο δείγμα είναι στερεό, κάντε ένα από τα ακόλουθα πράγματα.
12) Εάν το ακατέργαστο δείγμα είναι στερεό, κάντε ένα από τα ακόλουθα πράγματα.
α) Ιδανική κατάσταση: διαλύστε το στερεό στην ελάχιστη ποσότητα του εκλουόμενου (το πολύ μερικά ml).
β) Εάν το στερεό δεν είναι ιδιαίτερα διαλυτό ή δεν διαλύεται σε λίγα ml του εκλούοντος, διαλύστε το στην ελάχιστη ποσότητα διχλωρομεθανίου (λίγα ml το πολύ, Σχ. 7 α).
γ) Εάν το στερεό είναι αδιάλυτο στο εκλουόμενο, είναι επίσης δυνατή μια εναλλακτική διαδικασία. Διαλύστε το στερεό σε φιάλη στρογγυλού πυθμένα χρησιμοποιώντας λίγα ml διαλύτη χαμηλού βρασμού (π.χ. διχλωρομεθάνιο ή ακετόνη). Προσθέστε στη φιάλη περίπου 1 g πυριτίας ή αλουμίνας και, στη συνέχεια, αφαιρέστε τον διαλύτη στον περιστροφικό εξατμιστή για να αφήσετε ένα στερεό που περιέχει το δείγμα που έχει εναποτεθεί στο προσροφητικό υλικό. Με μια ίντσα εκλυτικού μέσου να βρίσκεται πάνω από τη γεμάτη στήλη (παραλείψτε την προσθήκη του στρώματος άμμου εάν χρησιμοποιείται αυτή η μέθοδος), ρίξτε το δείγμα που έχει προσροφηθεί με πυριτία στη στήλη χρησιμοποιώντας ένα ευρύστομο χωνί. Εάν προσκολληθεί σκόνη στο γυαλί, ξεπλύνετε το με περισσότερο εκλουστικό (συνεχίστε στο βήμα 15).
13) Προσθέστε προσεκτικά το δείγμα στη στήλη μέσω πιπέτας, στάζοντας το υγρό ή το διάλυμα απευθείας πάνω στην άμμο με το άκρο της πιπέτας όσο πιο κοντά μπορείτε να το καταφέρετε, όχι κάτω από τις πλευρές (Σχ. 7 β). Προσέξτε να μην εκτοξεύσετε το υγρό με δύναμη, ώστε να προκληθούν εσοχές στην άμμο ή στη στήλη πυριτίας/αλουμίνας.
14) Ξεπλύνετε το δοχείο δείγματος με λίγο διαλύτη (ή διχλωρομεθάνιο αν χρησιμοποιείται, Εικ. 7 γ) και προσθέστε το ξέπλυμα στη στήλη χρησιμοποιώντας την ίδια πιπέτα (για να ξεπλύνετε και την πιπέτα).
15) Ανοίξτε τη στρόφιγγα και αφήστε το υγρό να στάξει μέχρι το δείγμα να περάσει ακριβώς από το στρώμα άμμου (Εικ. 7 δ) και να εισέλθει στη λευκή περιοχή της στήλης (εφαρμόστε πίεση αέρα εάν αυτό διαρκεί περισσότερο από 20 δευτερόλεπτα).
16 ) Ξεπλύνετε απαλά τις πλευρές της στήλης με στροβιλιστικές κινήσεις χρησιμοποιώντας 1-2 πιπέτες γεμάτες με εκλυτικό υγρό για να ξεπλύνετε τυχόν εκτοξευμένο δείγμα. Αφήστε και πάλι το υγρό να στάξει (ή εφαρμόστε πίεση αέρα) μέχρι το δείγμα να ωθηθεί στο λευκό προσροφητικό υλικό.
Επαναλάβετε το βήμα έκπλυσης μέχρι να βεβαιωθείτε ότι ολόκληρο το δείγμα έχει εναποτεθεί στο προσροφητικό υλικό. Εάν κάποιο δείγμα εξακολουθεί να βρίσκεται στο στρώμα άμμου, ενδέχεται να διαλυθεί στο εκλουόμενο όταν προστεθεί περισσότερος διαλύτης, οδηγώντας σε απώλεια απόδοσης. Εάν η ένωση είναι έγχρωμη, το ξέπλυμα πρέπει να είναι εντελώς διαυγές.
14) Ξεπλύνετε το δοχείο δείγματος με λίγο διαλύτη (ή διχλωρομεθάνιο αν χρησιμοποιείται, Εικ. 7 γ) και προσθέστε το ξέπλυμα στη στήλη χρησιμοποιώντας την ίδια πιπέτα (για να ξεπλύνετε και την πιπέτα).
15) Ανοίξτε τη στρόφιγγα και αφήστε το υγρό να στάξει μέχρι το δείγμα να περάσει ακριβώς από το στρώμα άμμου (Εικ. 7 δ) και να εισέλθει στη λευκή περιοχή της στήλης (εφαρμόστε πίεση αέρα εάν αυτό διαρκεί περισσότερο από 20 δευτερόλεπτα).
16 ) Ξεπλύνετε απαλά τις πλευρές της στήλης με στροβιλιστικές κινήσεις χρησιμοποιώντας 1-2 πιπέτες γεμάτες με εκλυτικό υγρό για να ξεπλύνετε τυχόν εκτοξευμένο δείγμα. Αφήστε και πάλι το υγρό να στάξει (ή εφαρμόστε πίεση αέρα) μέχρι το δείγμα να ωθηθεί στο λευκό προσροφητικό υλικό.
Επαναλάβετε το βήμα έκπλυσης μέχρι να βεβαιωθείτε ότι ολόκληρο το δείγμα έχει εναποτεθεί στο προσροφητικό υλικό. Εάν κάποιο δείγμα εξακολουθεί να βρίσκεται στο στρώμα άμμου, ενδέχεται να διαλυθεί στο εκλουόμενο όταν προστεθεί περισσότερος διαλύτης, οδηγώντας σε απώλεια απόδοσης. Εάν η ένωση είναι έγχρωμη, το ξέπλυμα πρέπει να είναι εντελώς διαυγές.
α και β) Πλήρωση της δεξαμενής διαλύτη, γ και δ) Έκλουση της στήλης
Γεμίστε με το διαλύτη και εκλούστε τη στήλη
17) Προσθέστε προσεκτικά περισσότερο εκλυτικό μέσω πιπέτας (Εικ. 8 α), στροβιλίζοντας προς τα κάτω τις πλευρές, και στη συνέχεια, όταν το στρώμα άμμου δεν θα διαταράσσεται πλέον με τις προσθήκες, ρίξτε προσεκτικά μεγαλύτερες ποσότητες (Εικ. 8 β) του παρασκευασμένου εκλυτικού για να γεμίσετε τη δεξαμενή (ή γεμίστε με όση ποσότητα μπορεί να χρειαστεί). Το καθαρό εκλουστικό που συλλέγεται κατά τη συσκευασία της στήλης μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί.
18) Χρησιμοποιήστε πίεση αέρα για την ήπια και σταθερή έκλουση του δείγματος μέσω της στήλης (Εικ. 8 γ και δ). Όσες περισσότερες φορές ξεκινά και σταματά η πίεση, τόσο πιο πιθανό είναι να ραγίσει η στήλη. Είναι καλύτερο αν η πίεση μπορεί να διατηρηθεί ήπια και σταθερή καθ' όλη τη διάρκεια.
Ο βέλτιστος ρυθμός στάγδην κατά την έκλουση εξαρτάται από το μέγεθος της στήλης. Η ιδανική ροή εκλουόμενου είναι όταν ο διαλύτης στο κυλινδρικό τμήμα της στήλης πάνω από το προσροφητικό υλικό πέφτει με ρυθμό 5 cm ανά λεπτό. Επομένως, ο ρυθμός στάγδην ροής πρέπει να είναι βραδύτερος με μια στενή στήλη σε σύγκριση με μια φαρδύτερη στήλη. Ο ρυθμός σταγονορροής για στήλη μιας ίντσας θα πρέπει να είναι εκεί όπου οι μεμονωμένες σταγόνες μπορούν μόλις να διακριθούν. Ένα ρεύμα υγρού που εκρέει από το βύσμα με αυτό το μέγεθος στήλης είναι ελαφρώς υπερβολικά γρήγορο.
18) Χρησιμοποιήστε πίεση αέρα για την ήπια και σταθερή έκλουση του δείγματος μέσω της στήλης (Εικ. 8 γ και δ). Όσες περισσότερες φορές ξεκινά και σταματά η πίεση, τόσο πιο πιθανό είναι να ραγίσει η στήλη. Είναι καλύτερο αν η πίεση μπορεί να διατηρηθεί ήπια και σταθερή καθ' όλη τη διάρκεια.
Ο βέλτιστος ρυθμός στάγδην κατά την έκλουση εξαρτάται από το μέγεθος της στήλης. Η ιδανική ροή εκλουόμενου είναι όταν ο διαλύτης στο κυλινδρικό τμήμα της στήλης πάνω από το προσροφητικό υλικό πέφτει με ρυθμό 5 cm ανά λεπτό. Επομένως, ο ρυθμός στάγδην ροής πρέπει να είναι βραδύτερος με μια στενή στήλη σε σύγκριση με μια φαρδύτερη στήλη. Ο ρυθμός σταγονορροής για στήλη μιας ίντσας θα πρέπει να είναι εκεί όπου οι μεμονωμένες σταγόνες μπορούν μόλις να διακριθούν. Ένα ρεύμα υγρού που εκρέει από το βύσμα με αυτό το μέγεθος στήλης είναι ελαφρώς υπερβολικά γρήγορο.
α-γ) Συλλογή κλασμάτων, δ) Λειτουργία στήλης
Συλλογή κλασμάτων
19) Αρχίστε αμέσως να συλλέγετε το υγρό έκλουσης σε δοκιμαστικούς σωλήνες σε ένα ράφι (Εικ. 9 α). Βλέπε Εικ.1 για συστάσεις σχετικά με τους όγκους που πρέπει να συλλεχθούν σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα.20) Όταν γεμίσει ο πρώτος δοκιμαστικός σωλήνας ή αν έχει συλλεχθεί ένα ορισμένο ύψος υγρού, όπως συνιστάται από τον εκπαιδευτή σας ή την Εικ.1, μετακινήστε το ράφι για να αρχίσετε τη συλλογή σε διαφορετικό σωλήνα (Εικ.9 β και γ). Γεμίστε και διατηρήστε τους σωλήνες με τη σειρά στο ράφι.
Αυτά τα διαφορετικά σωληνάρια ονομάζονται "κλάσματα". Ο στόχος μιας στήλης είναι να συλλέγονται αρκετά μικρά κλάσματα ώστε τα περισσότερα (ή μερικά) κλάσματα να περιέχουν καθαρό υλικό. Εάν ο διαχωρισμός του μείγματος είναι δύσκολος (εάν το ΔRf των συστατικών είναι χαμηλό), μπορεί να είναι καλύτερο να συλλέγονται μικρά κλάσματα (π.χ. μισογεμάτοι σωλήνες).
Αυτά τα διαφορετικά σωληνάρια ονομάζονται "κλάσματα". Ο στόχος μιας στήλης είναι να συλλέγονται αρκετά μικρά κλάσματα ώστε τα περισσότερα (ή μερικά) κλάσματα να περιέχουν καθαρό υλικό. Εάν ο διαχωρισμός του μείγματος είναι δύσκολος (εάν το ΔRf των συστατικών είναι χαμηλό), μπορεί να είναι καλύτερο να συλλέγονται μικρά κλάσματα (π.χ. μισογεμάτοι σωλήνες).
α-γ) Υλικό έκπλυσης που εκτοξεύεται στο άκρο της στήλης, δ) Μαθητές που εκτελούν μια στήλη
21) Καθώς το υγρό αποστραγγίζεται από τη στήλη, συχνά εκτοξεύεται στις εξωτερικές πλευρές του άκρου της στήλης, και όταν ο διαλύτης εξατμίζεται, μπορεί να δείτε έναν δακτύλιο υλικού στο άκρο (θα δείτε έναν δακτύλιο στερεού υλικού εάν το συστατικό είναι στερεό, όπως στην Εικ. 10 β, ή ελαιώδη σταγονίδια εάν το συστατικό είναι υγρό). Εάν τα συστατικά είναι έγχρωμα, το άκρο της στήλης πρέπει να ξεπλυθεί (Εικ. 10 γ) όταν φαίνεται ότι ένα συστατικό έχει εκλουστεί πλήρως και πριν πλησιάσει το άλλο συστατικό.
22) Παρακολουθείτε περιοδικά τη στάθμη του εκλουόμενου και γεμίζετε ξανά πριν πέσει κάτω από το στρώμα άμμου.
22) Παρακολουθείτε περιοδικά τη στάθμη του εκλουόμενου και γεμίζετε ξανά πριν πέσει κάτω από το στρώμα άμμου.
α) Έκλουση, β) Προσθήκη οξικού αιθυλεστέρα για την αύξηση της πολικότητας του διαλύτη, γ) Η στάθμη του διαλύτη πλησιάζει το στρώμα άμμου, δ) Επαναπλήρωση
Πιθανή αύξηση της πολικότητας του διαλύτη
23) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα εκλουόμενο σε ολόκληρη τη στήλη, ιδίως εάν τα προς διαχωρισμό συστατικά έχουν παρόμοιες τιμές Rf. Ωστόσο, εάν τα συστατικά έχουν πολύ διαφορετικές τιμές Rf, η πολικότητα του διαλύτη μπορεί να αυξηθεί μετά την έκλουση ενός συστατικού από τη στήλη (Σχ. 11 α).
Η αύξηση της πολικότητας του διαλύτη θα κάνει τα συστατικά να ταξιδέψουν "γρηγορότερα". Υπάρχουν διάφοροι λόγοι για τους οποίους είναι επιθυμητή μια ταχύτερη έκλουση. Πρώτον, εάν ένα συστατικό έχει ήδη εξέλθει από τη στήλη, η στήλη έχει ήδη κάνει τη δουλειά της με το διαχωρισμό, οπότε η επιτάχυνση της διαδικασίας δεν θα επηρεάσει την καθαρότητα των κλασμάτων που συλλέγονται. Δεύτερον, όσο περισσότερο διαρκεί η λειτουργία μιας στήλης, τόσο ευρύτερες θα είναι οι ζώνες των συστατικών (λόγω διάχυσης) και η συλλογή μιας ευρείας ζώνης υλικού θα χρησιμοποιήσει (και θα σπαταλήσει) πολύ διαλύτη.
Η αύξηση της πολικότητας του διαλύτη θα κάνει τα συστατικά να ταξιδέψουν "γρηγορότερα". Υπάρχουν διάφοροι λόγοι για τους οποίους είναι επιθυμητή μια ταχύτερη έκλουση. Πρώτον, εάν ένα συστατικό έχει ήδη εξέλθει από τη στήλη, η στήλη έχει ήδη κάνει τη δουλειά της με το διαχωρισμό, οπότε η επιτάχυνση της διαδικασίας δεν θα επηρεάσει την καθαρότητα των κλασμάτων που συλλέγονται. Δεύτερον, όσο περισσότερο διαρκεί η λειτουργία μιας στήλης, τόσο ευρύτερες θα είναι οι ζώνες των συστατικών (λόγω διάχυσης) και η συλλογή μιας ευρείας ζώνης υλικού θα χρησιμοποιήσει (και θα σπαταλήσει) πολύ διαλύτη.
Περιέχει έναν μερικό κατάλογο των ελουτροπικών σειρών, έναν κατάλογο κοινών διαλυτών που κατατάσσονται σύμφωνα με τη "δύναμη διαλύτη" τους στη χρωματογραφία κανονικής φάσης. Ο πιο πολικός διαλύτης προκαλεί την πιο δραματική αύξηση του Rf
24) Για να αυξηθεί η πολικότητα του διαλύτη, ο πολικός διαλύτης μπορεί να στάζει απευθείας στο εκλουόμενο στη δεξαμενή της στήλης (Σχ. 11 β). Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείται μείγμα εξανίου:οξικού αιθυλεστέρα, η προσθήκη καθαρού οξικού αιθυλεστέρα στο εκλουόμενο που βρίσκεται επί του παρόντος στη δεξαμενή θα αυξήσει την πολικότητά του. Εάν η στάθμη του εκλουστικού διαλύματος είναι χαμηλή, θα μπορούσε να παρασκευαστεί ένα διάλυμα που περιέχει υψηλότερο ποσοστό του πιο πολικού συστατικού. Για παράδειγμα, εάν η στήλη χρησιμοποίησε αρχικά ένα μίγμα εξανίου:οξικού αιθυλεστέρα 4:1, η χρήση ενός μίγματος 1:1 θα ήταν ένας πιο πολικός διαλύτης.
25) Εκλούστε τη στήλη με τον πιο πολικό διαλύτη, όπως και προηγουμένως, και θυμηθείτε πάντα να παρακολουθείτε τη στάθμη του εκλούοντος και να την ξαναγεμίζετε (Εικ. 11 δ) πριν πέσει κάτω από το στρώμα άμμου.
26) Για να αυξήσετε την πολικότητα του διαλύτη, ο πολικός διαλύτης μπορεί να στάζει απευθείας στο εκλουόμενο στο δοχείο της στήλης (Εικ. 11 β). Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείται μείγμα εξανίου:οξικού αιθυλεστέρα, η προσθήκη καθαρού οξικού αιθυλεστέρα στο εκλουόμενο που βρίσκεται επί του παρόντος στη δεξαμενή θα αυξήσει την πολικότητά του. Εάν η στάθμη του εκλουστικού διαλύματος είναι χαμηλή, θα μπορούσε να παρασκευαστεί ένα διάλυμα που περιέχει υψηλότερο ποσοστό του πιο πολικού συστατικού. Για παράδειγμα, εάν η στήλη χρησιμοποίησε αρχικά ένα μίγμα εξανίου:οξικού αιθυλεστέρα 4:1, η χρήση ενός μίγματος 1:1 θα ήταν ένας πιο πολικός διαλύτης.
27) Εκλούστε τη στήλη με τον πιο πολικό διαλύτη, όπως και προηγουμένως, και θυμηθείτε πάντα να παρακολουθείτε τη στάθμη του εκλούοντος και να την ξαναγεμίζετε (Εικ. 11 δ) πριν πέσει κάτω από το στρώμα άμμου.
25) Εκλούστε τη στήλη με τον πιο πολικό διαλύτη, όπως και προηγουμένως, και θυμηθείτε πάντα να παρακολουθείτε τη στάθμη του εκλούοντος και να την ξαναγεμίζετε (Εικ. 11 δ) πριν πέσει κάτω από το στρώμα άμμου.
26) Για να αυξήσετε την πολικότητα του διαλύτη, ο πολικός διαλύτης μπορεί να στάζει απευθείας στο εκλουόμενο στο δοχείο της στήλης (Εικ. 11 β). Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείται μείγμα εξανίου:οξικού αιθυλεστέρα, η προσθήκη καθαρού οξικού αιθυλεστέρα στο εκλουόμενο που βρίσκεται επί του παρόντος στη δεξαμενή θα αυξήσει την πολικότητά του. Εάν η στάθμη του εκλουστικού διαλύματος είναι χαμηλή, θα μπορούσε να παρασκευαστεί ένα διάλυμα που περιέχει υψηλότερο ποσοστό του πιο πολικού συστατικού. Για παράδειγμα, εάν η στήλη χρησιμοποίησε αρχικά ένα μίγμα εξανίου:οξικού αιθυλεστέρα 4:1, η χρήση ενός μίγματος 1:1 θα ήταν ένας πιο πολικός διαλύτης.
27) Εκλούστε τη στήλη με τον πιο πολικό διαλύτη, όπως και προηγουμένως, και θυμηθείτε πάντα να παρακολουθείτε τη στάθμη του εκλούοντος και να την ξαναγεμίζετε (Εικ. 11 δ) πριν πέσει κάτω από το στρώμα άμμου.
α) Αρχική πλάκα TLC, β) Κλάσματα που συλλέχθηκαν από τη στήλη, γ) Επίστρωση κλασμάτων σε πλάκα TLC, δ) Οπτικοποιημένη πλάκα TLC με δείγματα από κάθε κλάσμα
Εύρεση και συμπύκνωση του επιθυμητού συστατικού
28) Για την εύρεση του επιθυμητού συστατικού στα κλάσματα του δοκιμαστικού σωλήνα, είναι χρήσιμο να κατανοήσουμε τη σχέση μεταξύ του Rf και της σειράς έκλουσης στη χρωματογραφία στήλης.Στη χρωματογραφία στήλης, το δείγμα εναποτίθεται μπροστά από τη στήλη και εκλούεται προς τα κάτω, ενώ στη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, το δείγμα κηλιδώνεται στον πυθμένα της πλάκας και εκλούεται προς τα πάνω. Επομένως, μια στήλη μπορεί να θεωρηθεί σαν μια ανάποδη πλάκα TLC. Μια ένωση με υψηλότερο Rf τρέχει "γρηγορότερα", δηλαδή θα καταλήξει ψηλότερα σε μια πλάκα TLC και θα συλλεχθεί πρώτη με μια στήλη. Στη στήλη που απεικονίζεται σε αυτή την ενότητα, το συστατικό με το χαμηλότερο Rf (πορτοκαλί στην πλάκα TLC στην Εικ. 13 α), είναι το συστατικό που συλλέγεται δεύτερο από τη στήλη.
29) Καθορίστε πρώτα ποιοι δοκιμαστικοί σωλήνες περιέχουν διαλυμένη ένωση.
29) Καθορίστε πρώτα ποιοι δοκιμαστικοί σωλήνες περιέχουν διαλυμένη ένωση.
α) Επισημάνετε ένα δείγμα από κάθε κλάσμα σε μια πλάκα TLC με ετικέτες με αριθμούς κλασμάτων που αντιστοιχούν στη σειρά με την οποία συλλέχθηκαν (Εικ.13 γ). Ίσως είναι καλύτερο να κηλιδώσετε κάθε δείγμα 2-3 φορές το ένα πάνω στο άλλο σε περίπτωση που τα κλάσματα είναι αραιά.
β) Εάν έχουν συλλεχθεί πολλά κλάσματα, γεγονός που σας κάνει να διστάζετε να πάρετε δείγμα από κάθε κλάσμα, μια μέθοδος για να εντοπίσετε τα άχρωμα κλάσματα που ενδέχεται να περιέχουν ένωση είναι να αναζητήσετε μια υποψία υπολείμματος που οδηγεί τους δοκιμαστικούς σωλήνες. Μετά την εξάτμιση, ένα στερεό υπόλειμμα (Εικ. 13) ή ελαιώδη σταγονίδια αφήνονται μερικές φορές στην κορυφή του δοκιμαστικού σωλήνα, καθιστώντας προφανές ότι τα κλάσματα αυτά περιέχουν κάτι περισσότερο από απλό διαλύτη. Δειγματοληπτήστε όλα τα κλάσματα κοντά στους σωλήνες που περιέχουν ορατό υπόλειμμα.
γ) Οπτικοποιήστε την πινακίδα TLC με στίγματα χρησιμοποιώντας υπεριώδες φως και/ή μια χρώση για να προσδιορίσετε ποια κλάσματα περιέχουν ένωση (Εικ.13 δ)
.
α) Εκπλυμένες πλάκες TLC των κλασμάτων που περιέχουν πιθανή ένωση, β) Συνδυασμός κλασμάτων, γ) Έκπλυση σωλήνα κλάσματος
α) Εκπλυμένες πλάκες TLC των κλασμάτων που περιέχουν πιθανή ένωση, β) Συνδυασμός κλασμάτων, γ) Έκπλυση σωλήνα κλάσματος
28) Εκτελέστε μια TLC όλων των κλασμάτων που περιέχουν ένωση, κηλιδώνοντας έως και πέντε δείγματα ανά πλάκα TLC πλάτους 2,5 cm. Για τον σκοπό αυτό μπορούν να χρησιμοποιηθούν πλατύτερες πλάκες TLC, εάν είναι διαθέσιμες.
29) Προσδιορίστε την ένωση με το επιθυμητό Rf με σύγκριση με την αρχική πλάκα TLC του ακατέργαστου κλάσματος. Επιλέξτε να διατηρήσετε τα κλάσματα που έχουν την επιθυμητή ένωση σε καθαρή μορφή, όπως αποδεικνύεται από την εκλούμενη πλάκα TLC. Για παράδειγμα, εάν είναι επιθυμητή η ένωση με το υψηλότερο Rf στην Εικ. 15 α, θα πρέπει να διατηρηθούν τα κλάσματα 6-10.
30) Συνδυάστε τα καθαρά κλάσματα σε φιάλη κατάλληλου μεγέθους με στρογγυλό πυθμένα (όχι περισσότερο από μισογεμάτη, Εικ. 15 β). Ξεπλύνετε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα με μια μικρή ποσότητα εκλυτικού μέσου (ή άλλου διαλύτη εάν η διαλυτότητα αποτελεί πρόβλημα) και προσθέστε το ξέπλυμα στη φιάλη με στρογγυλό πυθμένα (Εικ.15 γ).
31) Εξατμίστε τον διαλύτη στον περιστροφικό εξατμιστή για να παραμείνει η καθαρισμένη ένωση στη φιάλη.
29) Προσδιορίστε την ένωση με το επιθυμητό Rf με σύγκριση με την αρχική πλάκα TLC του ακατέργαστου κλάσματος. Επιλέξτε να διατηρήσετε τα κλάσματα που έχουν την επιθυμητή ένωση σε καθαρή μορφή, όπως αποδεικνύεται από την εκλούμενη πλάκα TLC. Για παράδειγμα, εάν είναι επιθυμητή η ένωση με το υψηλότερο Rf στην Εικ. 15 α, θα πρέπει να διατηρηθούν τα κλάσματα 6-10.
30) Συνδυάστε τα καθαρά κλάσματα σε φιάλη κατάλληλου μεγέθους με στρογγυλό πυθμένα (όχι περισσότερο από μισογεμάτη, Εικ. 15 β). Ξεπλύνετε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα με μια μικρή ποσότητα εκλυτικού μέσου (ή άλλου διαλύτη εάν η διαλυτότητα αποτελεί πρόβλημα) και προσθέστε το ξέπλυμα στη φιάλη με στρογγυλό πυθμένα (Εικ.15 γ).
31) Εξατμίστε τον διαλύτη στον περιστροφικό εξατμιστή για να παραμείνει η καθαρισμένη ένωση στη φιάλη.
α) Χρήση πίεσης αέρα για την ξήρανση της στήλης, β) Αφήνοντας τη στήλη να στεγνώσει ανάποδα, γ) Συλλογή των απορριμμάτων πυριτίου
Καθαρισμός της στήλης
32) Για να στεγνώσετε τη στήλη, εφαρμόστε πίεση αέρα για να στραγγίξετε το μεγαλύτερο μέρος του εκλουστικού από τη στήλη σε ένα δοχείο αποβλήτων. Στη συνέχεια, στεγνώστε περαιτέρω τη στήλη χρησιμοποιώντας μία από αυτές τις μεθόδους.
α) Αφήστε συνδεδεμένο ένα ήπιο ρεύμα αέρα να περνάει μέσα από τη στήλη για να την στεγνώσετε περαιτέρω καθώς καθαρίζετε άλλα πράγματα (Εικ. 16 α).
β) Σφίξτε τη στήλη ανάποδα πάνω από ένα μεγάλο δοχείο απορριμμάτων στον απορροφητήρα, έτσι ώστε το προσροφητικό να πέσει όταν στεγνώσει (Εικ.16 β). Αυτό θα πάρει πολύ χρόνο (μέχρι την επόμενη διδακτική ώρα), αλλά είναι μια επιλογή.
33) Όταν στεγνώσει, το προσροφητικό μπορεί να χυθεί από τη στήλη σε ένα δοχείο αποβλήτων στον απορροφητήρα (Εικ.16 γ).
Σημείωση για την ασφάλεια: Τα προσροφητικά σε σκόνη είναι ερεθιστικά για τους πνεύμονες και ο κίνδυνος τους επιδεινώνεται εάν η στήλη περιέχει υπολειμματικές ενώσεις που μπορούν τώρα να εισέλθουν στους πνεύμονές σας. Η έκχυση σκονών πυριτίας ή αλουμίνας πρέπει πάντα να γίνεται στον απορροφητήρα.
34) Όταν η πλειονότητα του προσροφητικού υλικού έχει συγκεντρωθεί σε δοχείο αποβλήτων, χρησιμοποιήστε νερό για να ξεπλύνετε τυχόν υπολείμματα στερεών στον νεροχύτη και, στη συνέχεια, ξεπλύνετε τη στήλη με ακετόνη σε ένα ποτήρι απορριμμάτων. Περαιτέρω, καθαρίστε τη στήλη με σαπούνι και νερό και στεγνώστε με τα μέρη του κρουνού χωριστά.
Σημείωση για την ασφάλεια: Τα προσροφητικά σε σκόνη είναι ερεθιστικά για τους πνεύμονες και ο κίνδυνος τους επιδεινώνεται εάν η στήλη περιέχει υπολειμματικές ενώσεις που μπορούν τώρα να εισέλθουν στους πνεύμονές σας. Η έκχυση σκονών πυριτίας ή αλουμίνας πρέπει πάντα να γίνεται στον απορροφητήρα.
34) Όταν η πλειονότητα του προσροφητικού υλικού έχει συγκεντρωθεί σε δοχείο αποβλήτων, χρησιμοποιήστε νερό για να ξεπλύνετε τυχόν υπολείμματα στερεών στον νεροχύτη και, στη συνέχεια, ξεπλύνετε τη στήλη με ακετόνη σε ένα ποτήρι απορριμμάτων. Περαιτέρω, καθαρίστε τη στήλη με σαπούνι και νερό και στεγνώστε με τα μέρη του κρουνού χωριστά.
Αντιμετώπιση προβλημάτων
Παρατηρούνται φυσαλίδες αέρα στη στήλη
Μια φυσαλίδα αέρα είναι ένας κενός θύλακας όπου δεν συμβαίνει εξισορρόπηση σταθερής-κινητής φάσης, οπότε τα συστατικά κινούνται γύρω από μια φυσαλίδα αέρα ταχύτερα από ό,τι θα έπρεπε. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε ανομοιόμορφες ζώνες έκλουσης, οι οποίες μπορεί να προκαλέσουν επικάλυψη εάν ο διαχωρισμός του μείγματος είναι δύσκολος (εάν τα συστατικά έχουν πολύ κοντινές τιμές Rf, όπως στην Εικ. 17).
Εάν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα στη στήλη και δεν έχει ακόμη εφαρμοστεί η άμμος ή το δείγμα, δώστε στη στήλη ένα καλό σπρώξιμο κατά τη διάρκεια της συσκευασίας για να απομακρυνθούν όλες οι φυσαλίδες αέρα. Επισκεφθείτε τον εκπαιδευτή σας εάν οι φυσαλίδες δεν μετακινούνται, καθώς μπορεί να προσεγγίζετε την εργασία πολύ προσεκτικά. Εάν η άμμος ή το δείγμα έχει ήδη εφαρμοστεί, είναι καλύτερο να αφήσετε τη στήλη ως έχει και να ελπίζετε ότι οι φυσαλίδες αέρα δεν θα επηρεάσουν το διαχωρισμό.
Οι ταινίες εκλούονται ανομοιόμορφα
Εάν τα συστατικά ενός μείγματος είναι χρωματισμένα, μπορεί να είναι εμφανές όταν οι ζώνες εκλούονται με στραβό τρόπο. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στο γεγονός ότι η στήλη είναι σφιγμένη σε ελαφρά διαγώνια θέση. Εάν η στήλη είναι σφιγμένη με λοξό τρόπο, τα συστατικά θα κινηθούν με λοξό τρόπο (Εικ. 18). Αυτό μπορεί να προκαλέσει προβλήματα διαχωρισμού εάν τα εξαρτήματα έχουν παρόμοιο Rf.
Δεν υπάρχει τρόπος επίλυσης αυτού του προβλήματος στη μέση μιας στήλης, αλλά αν τα εξαρτήματα έχουν πολύ διαφορετικές τιμές Rf, οι κεκλιμένες ζώνες μπορεί να μην έχουν καμία επίδραση στο διαχωρισμό. Στο μέλλον, φροντίστε να ελέγχετε ότι η στήλη είναι απόλυτα κάθετη τόσο προς την πλευρά όσο και προς την πλάτη και προς τα εμπρός και προς τα πίσω.
Last edited by a moderator:
