Въведение
Колонната хроматография е разширение на тънкослойната хроматография (ТСХ). Предполага се, че читателят има известен опит в лабораторната практика и се е занимавал с тънкослойна хроматография. Вместо пробата да се нанася върху тънък слой от силициев диоксид или алуминиев оксид, пробата се нанася върху цилиндър с адсорбент и разтворителят се подава непрекъснато под налягане, докато компонентите се източат напълно от цилиндъра. С тази модификация компонентите могат не само да се разделят, но и да се събират в различни контейнери, което позволява пречистване на смеси и отделяне на лекарства със замърсявания. Колонната хроматография (известна също като "светкавична хроматография"), се използва често в изследователски среди, за което свидетелства честото ѝ присъствие в процедурните раздели на статиите в списанията.
Процедурно обсъждане
Същите основни принципи на тънкослойната хроматография (ТСХ) се прилагат и за колонната хроматография. Всъщност преди извършване на колонна хроматография винаги се извършва TLC, за да се оцени ситуацията и да се определи правилното съотношение на разтворителите. За да се получи добро разделяне, идеално е желаният компонент да има Rf около 0,35 (прочетете за Rf в темата за TLC) и да е отделен от другите компоненти с поне 0,2 Rf единици. Ако петната, които трябва да се разделят, са много близки (ако разликата в Rf е < 0,2), най-добре е средата на петната да има Rf от 0,35. Rf близо до 0,35 е идеален, защото е достатъчно бавен, за да може да се осъществи уравновесяване на стационарната и подвижната фаза, но достатъчно бърз, за да се сведе до минимум разширяването на лентата от дифузия.
Има няколко променливи, които не са приложими за TLC, но които влияят върху разделянето на компонентите в колоновата хроматография. Те включват диаметъра на колоната, количеството на използвания адсорбент и скоростта на потока на разтворителя. Снимка. 1 показва препоръките за променливи в зависимост от размера на пробата и степента на разделяне на компонентите. При всички сценарии колоните трябва да се подготвят с височина между 12,5 и 15 cm.
Има няколко променливи, които не са приложими за TLC, но които влияят върху разделянето на компонентите в колоновата хроматография. Те включват диаметъра на колоната, количеството на използвания адсорбент и скоростта на потока на разтворителя. Снимка. 1 показва препоръките за променливи в зависимост от размера на пробата и степента на разделяне на компонентите. При всички сценарии колоните трябва да се подготвят с височина между 12,5 и 15 cm.
Например колона с дължина 2,5 cm трябва да може да пречисти около 400 mg материал, ако разделянето е добро (ΔRf > 0,2, третата колона на фиг. 1), или около 160 mg, ако разделянето е трудно (ΔRf > 0,1). Колоната трябва да може да се подготвя и елуира с около 200 ml разтворител, а фракциите могат да се събират с около 10 ml разтвор всяка.
Съществуват многобройни варианти на физическо изпълнение на колоната. Една от големите разлики в методите е начинът, по който се подготвя колоната. При метода на "сухата опаковка" сух силициев диоксид или алуминиев оксид се добавя директно към колоната и разтворителят се оставя да преминава през нея на порции, а след това под налягане. При метода на "мокрото опаковане" колоната първо се напълва с разтворител, след това сухият силициев диоксид или алуминиев оксид се разклаща леко, след което се опакова с налягане. При метода "каша" към силициевия диоксид или алуминиевия оксид в колба на Ерленмайер се добавя разтворител, който се изсипва върху колоната като каша, след което се напълва под налягане (налягането може да се създаде чрез спринцовка).
Важно е да се знае, че при добавянето на разтворител към силициев диоксид или алуминиев оксид се отделя топлина (те имат екзотермична топлина на разтваряне). В този раздел е представен методът на суспензията, като основната причина е, че той позволява тази екзотермична стъпка да се извърши в колба на Ерленмайер, вместо на колоната. Ако по време на опаковането на колоната се освободи топлина, тя може да генерира мехурчета от кипенето на разтворителя. Те могат да попречат на отделянето на колоната, ако не се отстранят по подходящ начин, и могат да напукат адсорбционния материал в колоната.
Съществуват многобройни варианти на физическо изпълнение на колоната. Една от големите разлики в методите е начинът, по който се подготвя колоната. При метода на "сухата опаковка" сух силициев диоксид или алуминиев оксид се добавя директно към колоната и разтворителят се оставя да преминава през нея на порции, а след това под налягане. При метода на "мокрото опаковане" колоната първо се напълва с разтворител, след това сухият силициев диоксид или алуминиев оксид се разклаща леко, след което се опакова с налягане. При метода "каша" към силициевия диоксид или алуминиевия оксид в колба на Ерленмайер се добавя разтворител, който се изсипва върху колоната като каша, след което се напълва под налягане (налягането може да се създаде чрез спринцовка).
Важно е да се знае, че при добавянето на разтворител към силициев диоксид или алуминиев оксид се отделя топлина (те имат екзотермична топлина на разтваряне). В този раздел е представен методът на суспензията, като основната причина е, че той позволява тази екзотермична стъпка да се извърши в колба на Ерленмайер, вместо на колоната. Ако по време на опаковането на колоната се освободи топлина, тя може да генерира мехурчета от кипенето на разтворителя. Те могат да попречат на отделянето на колоната, ако не се отстранят по подходящ начин, и могат да напукат адсорбционния материал в колоната.
Процедури стъпка по стъпка
а ) ТЛК на смес от фероцен/ацетилфероцен, б) Колонна хроматография
Колоната, изобразена в този раздел, показва пречистване на проба от 0,20 g, съдържаща смес от фероцен и ацетилфероцен (суровата TLC е на фиг. 2 а). В малки епруветки са събрани около 8 ml фракции и са използвани около 400 ml елуент.
а) TLC плака на сурова смес от фероцен/ацетилфероцен преди елуиране, б) след елуиране, в) колона с фрита, г) колона с памучен клин на дъното, д) колона без памучен клин (ще трябва да се постави преди употреба)
Извършване на TLC
1 ) Извършете TLC на пробата, която трябва да се пречисти (фиг. 3 а и б), за да определите подходящия разтворител за хроматографията. Желаният компонент трябва да има Rf около 0,35 и в идеалния случай трябва да бъде отделен от всички останали петна с поне 0,2 Rf единици.
2 ) Пригответе партида от елуент, който дава подходящата стойност на Rf. Подготвеното количество зависи от количеството на пробата, размера на колоната и от това дали се планира съставът на разтворителя да бъде променен по средата на процеса. (Вж. фиг. 1 за насоки и елутропната серия за тенденциите в "силата на разтворителя").
2 ) Пригответе партида от елуент, който дава подходящата стойност на Rf. Подготвеното количество зависи от количеството на пробата, размера на колоната и от това дали се планира съставът на разтворителя да бъде променен по средата на процеса. (Вж. фиг. 1 за насоки и елутропната серия за тенденциите в "силата на разтворителя").
Подготовка на опакованата колона
3 ) Набавете подходяща колона (вж. фиг. 1) и се уверете, че в близост до спирателния кран има нещо, което ще позволи преминаването на течност, но не и на твърдо вещество. Колоните могат да имат спечен диск (известен също като "фрита"), фиг. 3 в), или тапа от памук или стъклена вата, останала от предишния потребител (фиг. 3 г). Ако няма диск или запушалка (фиг. 3 д), забийте малка памучна или стъклена вата в дъното на колоната с помощта на дълга пръчка.
а ) Изсипване на силициев диоксид на височина 12,5-15 cm в аспиратора, б ) Изсипване на силициевия диоксид в колба на Ерленмайер, в и г) Създаване на суспензия
Бележка за безопасност: Прахообразните силициев диоксид и алуминиев оксид дразнят белите дробове и с тях винаги трябва да се работи внимателно в аспиратора. Разсипаният прах трябва да се изхвърля, като се избърше с мокра хартиена кърпа (ако е мокър, фините частици се разпръскват по-слабо).
5 ) В аспиратора изсипете адсорбента, измерен в колоната, в Ерленмайерова колба (фиг. 4б), след което добавете малко елуент (фиг. 4в). Направете рохкава суспензия, като въртите и разбърквате със стъклена бъркалка (фиг. 4 г), докато целият адсорбент се намокри напълно, газовите мехурчета се освободят и консистенцията е малко гъста, но лееща се.
а) Изливане на суспензията в колоната, б ) Изплакване на колбата, в ) Адсорбент, полепнал по стените на колоната, г) Изплакване на полепналия адсорбент
6 ) Поставете чаша или колба на Ерленмайер под притиснатата колона и отворете спирателния кран. С едно бързо движение завъртете и изсипете силициевата или алуминиевата суспензия в колоната, като използвате фуния с голямо устие (фиг. 5 а). Незабавно използвайте още елуент, за да изплакнете остатъчната суспензия от колбата на Ерленмайер (фиг. 5 б) и върху колоната.
7) Незабавно изплакнете силициевия диоксид или алуминиевия оксид от стените на резервоара на колоната, като използвате елуент и въртеливи движения с пипета на Пастьор (фиг. 5, букви в и г). Ако се остави да изсъхне, адсорбентът ще полепне по стъклото и няма да може лесно да се изплакне.
7) Незабавно изплакнете силициевия диоксид или алуминиевия оксид от стените на резервоара на колоната, като използвате елуент и въртеливи движения с пипета на Пастьор (фиг. 5, букви в и г). Ако се остави да изсъхне, адсорбентът ще полепне по стъклото и няма да може лесно да се изплакне.
а ) Разклащане на колоната, за да се отстранят въздушните мехурчета, б) Прилагане на въздушно налягане, в ) Добавяне на пясък, г) Изплакване на пясъка от страните
8) Тласкайте силно колоната, като използвате корков пръстен или кокалчетата на пръстите си (фиг. 6 а), за да отстраните всички въздушни мехурчета в колоната (които могат да причинят лошо отделяне или напукване на адсорбента в колоната) и да спомогнете за равномерното отлагане на адсорбента.
9) Приложете лек въздушен натиск върху горната част на колоната (фиг. 6 б), за да я компресирате, като спрете, когато нивото на елуента е на 1 cm от горната част на колоната. Ако се използва Т-образен адаптер с въздушната линия, както на фиг. 6 б, финият контрол на въздушния поток може да се осъществи чрез регулиране на щипката на гумената тръба. По време на целия процес на елуиране поддържайте бялата колона с адсорбент мокра, като нивото на елуента е над горната част на силициевия или алуминиевия оксид. Внимателно счупете уплътнението, за да прекратите прилагането на налягането, и затворете спирателния кран, за да предотвратите по-нататъшното изтичане на течността.
10 ) Добавете тънък слой пясък (фиг. 6 в), с височина приблизително 0,5 cm. Изплакнете страните на колоната с елуент, като използвате въртеливо движение, за да изместите пясъка от страните на стъклото (фиг. 6 г). Отворете спирателния кран и оставете течността да изтече, докато течността се окаже точно над слоя пясък. Приложете въздушно налягане, ако капенето е твърде бавно.
9) Приложете лек въздушен натиск върху горната част на колоната (фиг. 6 б), за да я компресирате, като спрете, когато нивото на елуента е на 1 cm от горната част на колоната. Ако се използва Т-образен адаптер с въздушната линия, както на фиг. 6 б, финият контрол на въздушния поток може да се осъществи чрез регулиране на щипката на гумената тръба. По време на целия процес на елуиране поддържайте бялата колона с адсорбент мокра, като нивото на елуента е над горната част на силициевия или алуминиевия оксид. Внимателно счупете уплътнението, за да прекратите прилагането на налягането, и затворете спирателния кран, за да предотвратите по-нататъшното изтичане на течността.
10 ) Добавете тънък слой пясък (фиг. 6 в), с височина приблизително 0,5 cm. Изплакнете страните на колоната с елуент, като използвате въртеливо движение, за да изместите пясъка от страните на стъклото (фиг. 6 г). Отворете спирателния кран и оставете течността да изтече, докато течността се окаже точно над слоя пясък. Приложете въздушно налягане, ако капенето е твърде бавно.
Добавете пробата
След като пробата се нанесе в колоната, започва надпревара с времето, тъй като дифузията ще започне да разширява материала. Пробата не трябва да се нанася, докато не сте готови да завършите колоната незабавно и изцяло. Този процес може да отнеме между 15 и 90 минути! Ако използвате епруветки за събиране на фракции, епруветките трябва да се подредят в стойка преди добавянето на пробата, а височината на колоната трябва да се регулира така, че стойката за епруветките да може да се плъзне отдолу.
а) Разтваряне на твърдо вещество с малко количество дихлорметан, б ) Нанасяне на пробата, в ) Изплакване на пробата в колбата, г) Прилагане на натиск за избутване на пробата върху колоната точно покрай пясъчния слой
11) Ако суровата проба е течност, използвайте я директно (преминете към стъпка 13).
12 ) Ако суровата проба е твърда, направете едно от следните действия.
12 ) Ако суровата проба е твърда, направете едно от следните действия.
а) Идеална ситуация: разтворете твърдото вещество в минимално количество елуент (най-много няколко ml).
б ) Ако твърдото вещество не е особено разтворимо или не се разтваря в няколко ml от елуента, разтворете го в минималното количество дихлорметан (най-много няколко ml, фиг. 7а).
в ) Ако твърдото вещество не е разтворимо в елуента, е възможна и алтернативна процедура. Разтворете твърдото вещество в колба с кръгло дъно, като използвате няколко ml разтворител с ниска степен на кипене (напр. дихлорметан или ацетон). Добавете към колбата приблизително 1 g силициев диоксид или алуминиев оксид, след което отстранете разтворителя на ротационен изпарител, за да оставите твърдо вещество, което съдържа пробата, отложена върху адсорбента. При един инч елуент, разположен върху напълнената колона (ако се използва този метод, се пропуска добавянето на пясъчния слой), пробата, адсорбирана от силициев диоксид, се изсипва върху колоната с помощта на фуния с широко гърло. Ако по стъклото полепне прах, изплакнете го с още елуент (преминете към стъпка 15).
13) Деликатно добавете пробата към колоната чрез пипета, като капвате течността или разтвора директно върху пясъка с накрайника на пипетата колкото е възможно по-близо, а не надолу по стените (фиг. 7 б). Внимавайте да не впръскате течността насила, така че да се получат вдлъбнатини в пясъка или колоната от силициев диоксид/алуминий.
14) Изплакнете контейнера с пробата с малко разтворител (или дихлорметан, ако е използван, фиг. 7 в) и добавете промивката към колоната, като използвате същата пипета (за да изплакнете и пипетата).
15) Отворете спирателния кран и оставете течността да изтече, докато пробата премине точно покрай пясъчния слой (фиг. 7 г) и попадне в бялата зона на колоната (приложете въздушно налягане, ако това отнеме повече от 20 секунди).
16) Внимателно изплакнете страните на колоната с въртеливо движение, като използвате 1-2 пипети, пълни с елуент, за да изплакнете всяка пръсната проба. Отново оставете течността да изтече (или приложете въздушно налягане), докато пробата се изтласка в белия адсорбент.
Повторете стъпката на изплакване, докато не се уверите, че цялата проба е нанесена върху адсорбента. Ако част от пробата все още се намира в пясъчния слой, тя може да се разтвори в елуента, когато се добави повече разтворител, което ще доведе до загуба на добив. Ако съединението е оцветено, изплакването трябва да е напълно прозрачно.
14) Изплакнете контейнера с пробата с малко разтворител (или дихлорметан, ако е използван, фиг. 7 в) и добавете промивката към колоната, като използвате същата пипета (за да изплакнете и пипетата).
15) Отворете спирателния кран и оставете течността да изтече, докато пробата премине точно покрай пясъчния слой (фиг. 7 г) и попадне в бялата зона на колоната (приложете въздушно налягане, ако това отнеме повече от 20 секунди).
16) Внимателно изплакнете страните на колоната с въртеливо движение, като използвате 1-2 пипети, пълни с елуент, за да изплакнете всяка пръсната проба. Отново оставете течността да изтече (или приложете въздушно налягане), докато пробата се изтласка в белия адсорбент.
Повторете стъпката на изплакване, докато не се уверите, че цялата проба е нанесена върху адсорбента. Ако част от пробата все още се намира в пясъчния слой, тя може да се разтвори в елуента, когато се добави повече разтворител, което ще доведе до загуба на добив. Ако съединението е оцветено, изплакването трябва да е напълно прозрачно.
а и б) Напълване на резервоара с разтворител, в и г) Елуиране на колоната
Напълнете с разтворител и елюирайте колоната
17) Деликатно добавете още елуент с помощта на пипета (фиг. 8 а), като въртите надолу по стените, и след това, когато пясъчният слой вече няма да се нарушава от добавките, внимателно налейте по-големи количества (фиг. 8 б) от приготвения елуент, за да напълните резервоара (или напълнете с толкова, колкото може да е необходимо). Чистият елуент, събран по време на опаковането на колоната, може да се използва повторно.
18) Използвайте налягането на въздуха, за да елуирате внимателно и равномерно пробата през колоната (фиг. 8 в и г). Колкото повече пъти се пуска и спира налягането, толкова по-голяма е вероятността колоната да се напука. Най-добре е, ако налягането може да се поддържа леко и стабилно през цялото време.
Оптималната скорост на капене по време на елуирането зависи от размера на колоната. Идеалният поток на елуента е, когато разтворителят в цилиндричния участък на колоната над адсорбента капе със скорост 5 cm в минута. Следователно скоростта на капене трябва да е по-бавна при тясна колона в сравнение с по-широка колона. Скоростта на капене за едносантиметрова колона трябва да бъде такава, че отделните капки да могат едва да се различат. Струята от течност, изливаща се от спирателния кран при този размер на колоната, е малко прекалено бърза.
18) Използвайте налягането на въздуха, за да елуирате внимателно и равномерно пробата през колоната (фиг. 8 в и г). Колкото повече пъти се пуска и спира налягането, толкова по-голяма е вероятността колоната да се напука. Най-добре е, ако налягането може да се поддържа леко и стабилно през цялото време.
Оптималната скорост на капене по време на елуирането зависи от размера на колоната. Идеалният поток на елуента е, когато разтворителят в цилиндричния участък на колоната над адсорбента капе със скорост 5 cm в минута. Следователно скоростта на капене трябва да е по-бавна при тясна колона в сравнение с по-широка колона. Скоростта на капене за едносантиметрова колона трябва да бъде такава, че отделните капки да могат едва да се различат. Струята от течност, изливаща се от спирателния кран при този размер на колоната, е малко прекалено бърза.
а-в ) Събиране на фракции, г ) Пускане на колона
Събиране на фракции
19 ) Незабавно започнете да събирате елуиращата течност в епруветки върху стойка (фиг. 9 а). Вижте фиг. 1 за препоръки относно обемите, които да се събират във всяка епруветка.20) Когато първата епруветка се напълни или ако е събрана определена височина на течността, както е препоръчано от вашия преподавател или от фиг. 1, преместете стойката, за да започнете да събирате в друга епруветка (фиг. 9 б и в). Напълнете и поддържайте епруветките в ред върху стойката.
Тези различни епруветки се наричат "фракции". Целта на колоната е да събира достатъчно малки фракции, така че повечето (или някои) фракции да съдържат чист материал. Ако разделянето на сместа е трудно (ако ΔRf на компонентите е ниско), може би е най-добре да се събират малки фракции (напр. наполовина напълнени епруветки).
Тези различни епруветки се наричат "фракции". Целта на колоната е да събира достатъчно малки фракции, така че повечето (или някои) фракции да съдържат чист материал. Ако разделянето на сместа е трудно (ако ΔRf на компонентите е ниско), може би е най-добре да се събират малки фракции (напр. наполовина напълнени епруветки).
а-в) Материал за изплакване, пръснат върху върха на колоната, г) Ученици, които пускат колона
21) Когато течността се оттича от колоната, тя често се разпръсква върху външните страни на върха на колоната и когато разтворителят се изпари, може да видите пръстен от материал върху върха (ще видите пръстен от твърдо вещество, ако компонентът е твърдо вещество, както на фиг. 10 б, или мазни капки, ако компонентът е течност). Ако компонентите са оцветени, върхът на колоната трябва да се изплакне (фиг. 10 в), когато изглежда, че единият компонент е напълно елуиран и преди да се приближи другият компонент.
22) Периодично следете нивото на елуента и го допълвайте, преди да е спаднало под пясъчния слой.
22) Периодично следете нивото на елуента и го допълвайте, преди да е спаднало под пясъчния слой.
а ) Елуиране, б) Добавяне на етилов ацетат за увеличаване на полярността на разтворителя, в ) Нивото на разтворителя се доближава до пясъчния слой, г) Допълване
Възможно е да увеличите полярността на разтворителя
23) Може да се използва един елуент за цялата колона, особено ако компонентите, които трябва да се разделят, имат сходни стойности на Rf. Ако обаче компонентите имат много различни стойности на Rf, полярността на разтворителя може да се увеличи, след като един от компонентите се елуира от колоната (фиг. 11 а).
Повишаването на полярността на разтворителя ще накара компонентите да се движат "по-бързо". Има няколко причини, поради които се желае по-бързо елуиране. Първо, ако един компонент вече е излязъл от колоната, тя вече е свършила работата си по разделянето, така че ускоряването на процеса няма да повлияе на чистотата на събраните фракции. Второ, колкото по-дълго време е необходимо за пускане на колоната, толкова по-широки ще бъдат лентите на компонентите (поради дифузия), а събирането на широка лента от материал ще използва (и ще изхаби) много разтворител.
Повишаването на полярността на разтворителя ще накара компонентите да се движат "по-бързо". Има няколко причини, поради които се желае по-бързо елуиране. Първо, ако един компонент вече е излязъл от колоната, тя вече е свършила работата си по разделянето, така че ускоряването на процеса няма да повлияе на чистотата на събраните фракции. Второ, колкото по-дълго време е необходимо за пускане на колоната, толкова по-широки ще бъдат лентите на компонентите (поради дифузия), а събирането на широка лента от материал ще използва (и ще изхаби) много разтворител.
Съдържа частичен списък на елуотропните серии - списък на обичайните разтворители, подредени според тяхната "разтворителна сила" в нормалната фазова хроматография. По-полярният разтворител води до най-драстично увеличение на Rf
24) За да се увеличи полярността на разтворителя, полярният разтворител може да се капне директно в елуента на резервоара на колоната (фиг. 11 б). Например, ако се използва смес от хексан и етилов ацетат, добавянето на чист етилов ацетат към елуента, който в момента се намира в резервоара, ще увеличи неговата полярност. Ако нивото на елуента е ниско, може да се приготви разтвор, който съдържа по-висок процент от по-полярния компонент. Например, ако в колоната първо е използвана смес от хексан и етилов ацетат в съотношение 4:1, използването на смес в съотношение 1:1 би било по-полярен разтворител.
25) Елюирайте колоната с по-полярния разтворител, както преди, като винаги не забравяте да следите нивото на елуента и да го доливате (фиг. 11 г), преди да е спаднал под пясъчния слой.
26) За да се увеличи полярността на разтворителя, полярният разтворител може да се капне директно в елуента на резервоара на колоната (фиг. 11 б). Например, ако се използва смес хексан:етилацетат, добавянето на чист етилацетат към елуента, който в момента се намира в резервоара, ще увеличи неговата полярност. Ако нивото на елуента е ниско, може да се приготви разтвор, който съдържа по-висок процент от по-полярния компонент. Например, ако в колоната първо е използвана смес от хексан и етилов ацетат в съотношение 4:1, използването на смес в съотношение 1:1 би било по-полярен разтворител.
27) Елюирайте колоната с по-полярния разтворител, както преди, като винаги не забравяте да следите нивото на елуента и да го доливате (фиг. 11 г), преди да е спаднал под пясъчния слой.
25) Елюирайте колоната с по-полярния разтворител, както преди, като винаги не забравяте да следите нивото на елуента и да го доливате (фиг. 11 г), преди да е спаднал под пясъчния слой.
26) За да се увеличи полярността на разтворителя, полярният разтворител може да се капне директно в елуента на резервоара на колоната (фиг. 11 б). Например, ако се използва смес хексан:етилацетат, добавянето на чист етилацетат към елуента, който в момента се намира в резервоара, ще увеличи неговата полярност. Ако нивото на елуента е ниско, може да се приготви разтвор, който съдържа по-висок процент от по-полярния компонент. Например, ако в колоната първо е използвана смес от хексан и етилов ацетат в съотношение 4:1, използването на смес в съотношение 1:1 би било по-полярен разтворител.
27) Елюирайте колоната с по-полярния разтворител, както преди, като винаги не забравяте да следите нивото на елуента и да го доливате (фиг. 11 г), преди да е спаднал под пясъчния слой.
а ) Оригинална TLC плака, б ) Фракции, събрани от колоната, в) Нанасяне на фракциите върху TLC плака, г) Визуализирана TLC плака с проби от всяка фракция
Намиране и концентриране на желания компонент
28) При намирането на желания компонент във фракциите от епруветката е полезно да се разбере връзката между Rf и реда на елуиране в колонната хроматография.При колонната хроматография пробата се нанася начело на колоната и се елуира надолу, докато при тънкослойната хроматография пробата се нанася на дъното на плаката и се елуира нагоре. Следователно колоната може да се разглежда като обърната надолу TLC плака. Съединение с по-високо Rf се движи "по-бързо", което означава, че то ще се окаже по-високо върху TLC плочата и ще бъде събрано първо с колона. В колоната, показана в този раздел, компонентът с по-нисък Rf (оранжев на TLC плочата на фиг. 13 а) е компонентът, който се събира втори от колоната.
29) Първо определете кои епруветки съдържат разтворено съединение.
29) Първо определете кои епруветки съдържат разтворено съединение.
а ) Нанесете проба от всяка фракция върху TLC плаката, обозначена с номера на фракциите, съответстващи на реда, в който са събрани (фиг. 13 в). Най-добре е всяка проба да се нанесе 2-3 пъти една върху друга, в случай че фракциите са разредени.
б) Ако са събрани много фракции, поради което се колебаете дали да вземете проба от всяка фракция, един от методите за идентифициране на безцветните фракции, които може да съдържат съединение, е да търсите следи от остатъци, водещи до епруветките. След изпаряването понякога на върха на епруветката остава твърд остатък (фиг. 13) или маслени капчици, което прави очевидно, че тези фракции съдържат нещо повече от разтворител. Вземете проба от всички фракции в близост до епруветките, които съдържат видими остатъци.
в) Визуализирайте зацапаната TLC плака, като използвате UV светлина и/или оцветител, за да определите кои фракции съдържат съединение (фиг. 13 г)
а ) Елуирани TLC плаки на фракции, съдържащи възможно съединение, б ) Комбиниране на фракции, в) Изплакване на епруветка с фракция
28) Извършете TLC на всички фракции, които съдържат съединение, като нанесете до пет проби на TLC плака с ширина 2,5 cm. За тази цел могат да се използват по-широки TLC плаки, ако има такива.
29) Идентифицирайте съединението с желаното Rf чрез сравнение с оригиналната сурова TLC плака. Изберете да запазите фракциите, които имат желаното съединение в чиста форма, както се вижда от елуираната TLC плака. Например, ако на фиг. 15а се търси съединението с по-високо Rf, трябва да се запазят фракции 6-10.
30 ) Комбинирайте чистите фракции в колба с кръгло дъно с подходящ размер (не по-пълна от половината, фиг. 15 б). Изплакнете всяка епруветка с малко количество елуент (или друг разтворител, ако разтворимостта е проблем) и добавете изплакването към колбата с кръгло дъно (фиг. 15, буква в).
31) Изпарете разтворителя на ротационен изпарител, за да оставите пречистеното съединение в колбата.
29) Идентифицирайте съединението с желаното Rf чрез сравнение с оригиналната сурова TLC плака. Изберете да запазите фракциите, които имат желаното съединение в чиста форма, както се вижда от елуираната TLC плака. Например, ако на фиг. 15а се търси съединението с по-високо Rf, трябва да се запазят фракции 6-10.
30 ) Комбинирайте чистите фракции в колба с кръгло дъно с подходящ размер (не по-пълна от половината, фиг. 15 б). Изплакнете всяка епруветка с малко количество елуент (или друг разтворител, ако разтворимостта е проблем) и добавете изплакването към колбата с кръгло дъно (фиг. 15, буква в).
31) Изпарете разтворителя на ротационен изпарител, за да оставите пречистеното съединение в колбата.
а) Използване на въздушно налягане за изсушаване на колоната, б ) Оставяне на колоната да изсъхне обърната надолу, в ) Събиране на отпадъчния силициев диоксид
Почистванена колоната
32) За да изсушите колоната, приложете въздушно налягане, за да изтече по-голямата част от елуента от колоната в контейнер за отпадъци. След това доизсушете колоната, като използвате един от следните методи.
а ) Оставете свързана лека въздушна струя да преминава през колоната, за да я изсуши допълнително, докато почиствате други неща (фиг. 16 а).
б) Затегнете колоната с главата надолу над голяма чаша за отпадъци в аспиратора, така че адсорбентът да падне, когато изсъхне (фиг. 16, буква б). Това ще отнеме много време (до следващия учебен час), но е вариант.
33) Когато изсъхне, адсорбентът може да се изсипе от колоната в контейнер за отпадъци в аспиратора (фиг.16 в).
Бележка за безопасност: Прахообразните адсорбенти дразнят белите дробове и опасността от тях се увеличава, ако колоната съдържа остатъчни съединения, които сега могат да попаднат в белите дробове. Изсипването на прахообразните силициев или алуминиев оксид винаги трябва да се извършва в аспиратора.
34) Когато по-голямата част от адсорбента е събрана в контейнера за отпадъци, използвайте вода, за да изплакнете всички остатъчни твърди вещества в мивката, а след това изплакнете колоната с ацетон в чаша за отпадъци. Освен това почистете колоната със сапун и вода и я изсушете, като разделите частите на спирателния кран.
Бележка за безопасност: Прахообразните адсорбенти дразнят белите дробове и опасността от тях се увеличава, ако колоната съдържа остатъчни съединения, които сега могат да попаднат в белите дробове. Изсипването на прахообразните силициев или алуминиев оксид винаги трябва да се извършва в аспиратора.
34) Когато по-голямата част от адсорбента е събрана в контейнера за отпадъци, използвайте вода, за да изплакнете всички остатъчни твърди вещества в мивката, а след това изплакнете колоната с ацетон в чаша за отпадъци. Освен това почистете колоната със сапун и вода и я изсушете, като разделите частите на спирателния кран.
Отстраняване на неизправности
В колоната се наблюдават въздушни мехурчета
Въздушното мехурче е празен джоб, в който не се извършва уравновесяване на неподвижната и подвижната фаза, така че компонентите се движат по-бързо около въздушното мехурче, отколкото би трябвало. Това може да доведе до неравномерно елуиране на ленти, което може да доведе до припокриване, ако разделянето на сместа е трудно (ако компонентите имат много близки стойности на Rf, както на фиг. 17).
Ако в колоната се наблюдават въздушни мехурчета и пясъкът или пробата все още не са нанесени, разклатете добре колоната по време на опаковането, за да отстраните всички въздушни мехурчета. Ако мехурчетата не помръдват, обърнете се към инструктора си, тъй като може би подхождате твърде деликатно към задачата. Ако пясъкът или пробата вече са нанесени, най-добре е да оставите колоната така, както е, и да се надявате, че въздушните мехурчета няма да повлияят на разделянето.
Групите се елиминират неравномерно
Ако компонентите на дадена смес са оцветени, това може да е очевидно, когато лентите се елюират накриво. Това най-вероятно се дължи на това, че колоната е притисната под лек диагонал. Ако колоната е притисната под наклон, компонентите ще се движат под наклон (фиг. 18). Това може да доведе до проблеми с разделянето, ако компонентите имат сходно Rf.
Няма начин да се реши този проблем по средата на колоната, но ако компонентите имат много различни стойности на Rf, наклонените ленти може да нямат ефект върху разделянето. В бъдеще не забравяйте да проверявате дали колоната е напълно вертикална както в посока от страна към страна, така и отпред назад.
Last edited by a moderator:
